囊性肝包虫囊肿周围肝内管道的病理解剖学观察＊

杨宏强，王 菊，李 江，马少波，卞志远，赵 瑾，张示杰，陈孝平

2.石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科；

3.石河子大学医学院

囊型肝包虫病是世界畜牧地区常见的人兽共患疾病。包虫生长发育过程即是包虫与宿主相互作用、相互影响的过程。大量的研究表明宿主对包虫的抑制主要与宿主的免疫反应有关[1－2]，而包虫对宿主的影响主要表现在对寄生的组织器官结构和功能的损伤。在囊型肝包虫的生长发育过程中，随着包虫囊的不断增大，导致肝脏组织发生了严重的病理解剖学改变。由于不易获得病理组织标本，对人肝包虫病患者的肝内组织结构尤其是肝内管道的病理学研究受到限制，相关报道较少见，本研究通过对近年来收集的手术切除的人囊型肝包虫及其周围的肝内血管及胆管标本，进行病理组织学研究，描述囊性肝包虫外囊及周围肝内血管、胆管的病理解剖学改变，探讨其对肝脏产生的影响。

1 材料及方法

1.1 标本来源 选取我院2009年6月至2010年6月囊性肝包虫患者的新鲜手术标本42例，其中肝右叶包虫39例，肝左叶包虫3例，所有标本均包括肝包虫外囊及其外面附着的四级及四级以上肝内管道（实验组）。病理教研室提供无肝病尸检者肝组织5例（四级Glisson系统内管道及周围肝组织）做正常对照（对照组），其中肝右叶组织4例，肝左叶组织1例。

1.2 主要试剂和仪器 Masson三色试剂盒、ACTIN、VEGF单克隆抗体均购于DAKO公司，通用型二抗及DAB显色试剂盒购自于北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 大体标本观察 大体标本观察肝包虫周围血管、胆管（Glisson系统为主）及周围组织的病理解剖学改变。

1.4 制片 实验组取包虫外囊及其表面附着的Glisson鞘内四级管道，对照组取肝脏对应级别的Glisson系统组织标本经10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋；制备4μm厚的组织切片备用。

1.5 标本组织HE染色 组织切片用60。C烘烤30min后进行常规HE染色，显微镜下观察。

1.6 Masson染色 切片脱蜡至水，按Masson三色试剂盒说明书：加A1、A2液1∶1混和液，染色15min；流水稍洗，酸酒精分化，流水冲洗10min；加B液5min；蒸馏水洗去B液2min；加C液5min，倒去C液，加D液染25min；1%冰醋酸洗去D液约1 min；95%酒精洗3次，每次1min；无水乙醇脱水5 min，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察。

1.7 免疫组织化学染色（SP法） 组织均经常规固定，脱水石蜡包埋，每例连续切片10张，切片厚度5 μm，37。C烘箱过夜备用。每例均与HE染色对照。石蜡切片经常规脱蜡至水，将切片浸入0.1mol／L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中，微波修复10min（高火，750W），自然冷却至室温，PBS缓冲液5min×3次，10%山羊血清封闭，37。C孵育10min，滴加一抗（ACTIN、VEGF抗体，工作浓度均为1∶100）。4。C孵育过夜；PBS浸洗玻片3次（每次5min），37。C复温1h；加通用型二抗，37。C孵育30min，DAB显色，苏木素复染10min，l%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

2 结 果

2.1 大体病理标本观察结果 肝包虫外囊组织质韧，自肝剥离面呈黄白色，表面较光滑。可见树枝状的Glisson系统内血管及胆管失去原有的解剖位置，包绕、附着于外囊表面，管道与外囊粘连紧密，不能分离，其所属肝组织消失。外囊及附着的肝内管道的切面可以观察到，粘附于外囊的管道略隆起，近肝门段管道管腔残存而至远端渐闭锁（图1）。

图1 完整的肝包虫外囊及其表面附着的树枝状的Glisson系统（▲所示）左上角图显示外囊及其表面附着的肝内管道横剖面Fig.1 Unbroken ectocyst of hepatic hydatid cyst and blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（▲）attached on the surface of ectocyst，transverse plane of the Glisson＇s system attached on the surface of ectocyst is showed in left－upper figure

2.2 苏木素－伊红染色镜下观察结果 对照组5例均见正常肝内Glisson鞘内结构完整，各种管道排列整齐，管腔饱满，周围可见疏松结缔组织包绕。肝动脉管腔规则，管径较小，管壁厚，而且内膜、中膜、外膜分界清晰。门静脉管径明显较肝动脉及胆管大，管壁薄。胆管管腔规则，粘膜、肌层结构完整（图2－Ⅰ）。高倍镜下观察汇管区结构清晰，肝细胞围绕汇管区排列整齐，大小正常，细胞内结构清晰，未见明显变性、坏死。（图3－Ⅰ）。

实验组42例囊性肝包虫周围外膜内Glisson鞘内结构紊乱，各种管道排列杂乱，管道周围纤维组织明显增生，管道与周围组织分界不清。肝动脉管径减小，动脉壁厚薄不一，而且内膜、中膜、外膜分界不及对照组清晰。门静脉管径明显减小，管腔变得扁平，管壁变薄。胆管管腔不规则，管径减小，而胆管壁变厚（图2－Ⅱ）。肝包虫囊肿周围的肝组织结构形态异常、萎缩，汇管区结构不清，可见肝细胞大小不均、变性、坏死（图3－Ⅱ）。

图2 －Ⅰ 正常肝脏肝组织及肝内Glisson系统管道（右肝，四级）（HE×40）；图2－Ⅱ 囊型肝包虫外囊壁及其表面附着的肝内Glisson系统管道（右肝，四级）及周围肝组织（HE×40）。图3－Ⅰ 正常肝组织（HE×400）；图3－Ⅱ 肝包虫外囊周围的肝组织（HE×400）。（A－肝内动脉，B－肝内胆管，C－肝包虫外囊，V－门静脉）Fig.2－Ⅰ Hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of normal hepatic tissue of human（HE，×40）Fig.2－Ⅱ Blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（right lobe of liver，4th stage）hepatic tissue attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（HE，×40）.Fig.3－Ⅰ Normal hepatic tissue（HE，×400）.Fig.3－Ⅱ Hepatic tissue attached on the surface of ectocyst（HE，×400）.（A－Intrahepatic Artery，B－Intrahepatic bile ducts，C－Ectocyst of hepatic hydatid cyst，V－Portal Vein）

2.3 Masson染色结果 Masson染色显示：肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝黑色。镜下观察，对照组5例正常肝内Glisson鞘内以蓝色为主，组织疏松，胶原纤维少，各种管道结构层次清楚。动脉管壁厚，其中膜可见大量红染的平滑肌组织和少量蓝染的胶原纤维。门静脉壁蓝染，可见少量红染组织，即有大量的胶原纤维和少量的平滑肌组织。胆管壁以蓝染为主，偶见红染组织（图4－Ⅰ）。实验组42例均可见肝包虫外囊表面附着的Glisson鞘内呈蓝染纤维组织较对照组明显增多。动脉管壁结构层次不清，中膜蓝染组织明显增多，即平滑肌减少而胶原纤维明显增多。门静脉壁蓝染，即含有大量的胶原纤维。胆管壁蓝染，管壁变薄，未见红染组织（图4－Ⅱ）。

2.4 Actin免疫组化结果Actin在管道内平滑肌组织呈阳性表达。显微镜下观察，对照组可见Glisson鞘内肝动脉、门静脉、胆管壁内Actin均有着色，呈阳性表达（图5－Ⅰ）。实验组可见肝包虫外囊表面附着的的Glisson鞘内动脉管壁着色明显变淡；门静脉壁着色变淡，呈弱阳性表达；胆管壁着色亦明显减少，呈弱阳性或阴性表达（图5－Ⅱ），Actin染色结果说明实验组中各管道的平滑肌成分较对照组明显减少。

2.5 VEGF免疫组化结果 血管内皮生长因子（VEGF）主要在新生的小血管及小胆管上皮细胞内呈阳性表达。对照组：5例正常肝内Glisson鞘内偶有VEGF阳性表达（图6－Ⅰ），未见新生的小血管及小胆管。实验组：42例肝包虫外囊与肝组织间均可见大量新生之小血管及小胆管增生，其上皮细胞内VEGF呈阳性表达（图6－Ⅱ）。

3 讨 论

以往的包虫病引起肝内管道病变的研究多局限于影像学范畴[3－5]，主要的原因是囊型肝包虫病传统的手术方式是内囊摘除术，这种术式很难获得肝包虫周围肝内管道的临床病理标本，而无法对其进行组织病理学观察。新的根治性手术——外膜内外囊完整切除术的应用，不但明显提高了手术疗效[6－7]，同时可以获得包虫囊肿周围病变的肝内管道标本，对其进行病理学研究。

本课题组在肝包虫外膜内外囊切除术中发现，肝包虫囊肿周围Glisson系统内的血管和胆管变形、移位，失去原有的解剖位置，和术前的影像学结果相符[4]。本研究进一步观察了囊肿周围病变的肝内管道的病理变化，发现肝包虫周围肝内管道失去原有的解剖位置，包绕贴敷于外囊。HE镜下观察见Glisson鞘变形，其内肝动脉、门静脉及胆管关系紊乱，管腔变窄、变形。这些改变均提示：囊性肝包虫在膨胀性生长过程中，长期挤压周围肝内管道，造成肝内管道解剖位置、结构发生改变。

本课题组前期研究中提出：肝包虫外囊与肝实质间还存在着一层新的膜样纤维结构—“外膜”，本研究进一步证实了肝包虫外囊周围病变的Glisson鞘及其内的肝动脉、门静脉及胆管是“外膜”的重要组成部分。本实验Masson及Actin染色镜下观察结果显示：肝包虫外膜内Glisson鞘内的纤维组织明显增多；肝动脉、门静脉及胆管壁内平滑肌成份明显减少而胶原纤维成份明显增多，管壁分层结构基本消失，与周围纤维结构分界不清，提示Glisson鞘及其内管道结构发生了纤维化。本课题组先前的研究结果表明TGF－β1和CTGF在肝包虫外囊与肝组织间的外膜层内有高表达[8]，这些与纤维化密切相关的基因可能参与了Glisson鞘及其内管道结构的纤维化的过程。

图4 －Ⅰ 正常右肝内Glisson系统管道（四级）（Masson×100）；图4－Ⅰ 右肝囊型肝包虫及其表面附着的肝内Glisson系统管道（四级）（Masson×100）。图5－Ⅰ 正常右肝内Glisson系统管道（四级）Actin表达（免疫组化×100）；图5－Ⅱ 右肝囊型肝包虫及其表面附着的肝内Glisson系统管道（四级）Actin表达（免疫组化×100）。图6－Ⅰ 正常右肝内Glisson系统管道（四级）VEGF表达（免疫组化×400）；（A－肝内动脉，B－肝内胆管，C－肝包虫外囊，V－门静脉）图6－Ⅱ 右肝囊型肝包虫与肝组织间VEGF表达，此图中B为增生的胆管，V为增生的血管（免疫组化×400）Fig.4－Ⅱ Normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（Masson stain，×100）Fig.4－Ⅱ Blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（right lobe of liver，4th stage）attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（Masson stain，×100）Fig.5－Ⅰ Expression of Actin in normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（SP，×100）Fig.5－Ⅱ Expression of Actin in blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（SP，×100）Fig.6－Ⅰ Expression of VEGF in normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（SP，×100）（A－Intrahepatic Artery，B－Intrahepatic bile ducts，C－Ectocyst of hepatic hydatid cyst，V－Portal Vein）Fig.6－Ⅱ Expression of VEGF between hepatic tissue and ectocyst hepatic hydatid cyst of human，B is proliferative bile ducts and V is proliferative blood vessel（SP，×100）

随着肝包虫囊肿的生长，其周围的肝组织萎缩甚至消失。组织萎缩甚至消失的主要原因有两方面，即细胞凋亡和坏死。前期研究结果表明，凋亡不是包虫周围肝细胞消失的主要原因[9]，包虫外囊邻近的肝细胞发生变性坏死，因此，提示坏死可能是肝包虫周围肝细胞消失的主要方式。坏死是因病理因素而导致的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。本研究用VEGF染色镜下观察外膜内肝内管道周围有大量新生小血管及小胆管增生，间接说明局部组织存在缺血缺氧现象。囊性肝包虫周围肝内管道解剖位置、组织结构的改变及其纤维化等解剖病理性改变，会导致其功能发生改变，不能维持局部肝组织正常血供及营养供应，导致局部组织缺血缺氧，细胞因缺血缺氧营养不良，而发生萎缩、坏死，并且细胞坏死又可进一步加重周围组织的纤维化。

综上所述，囊性肝包虫在慢性膨胀性生长过程中，对囊肿周围肝内管道长期压迫，肝内管道移位变形并发生纤维化，其功能受到严重影响，导致局部组织缺血缺氧，而组织缺血缺氧是导致肝包虫囊肿周围的肝组织萎缩、变性、坏死而消失的原因之一。

[1]Da Silva AM.Human echinococcosis：a neglected disease[J].Gastroenterol Res Pract，2010：2010.

[2]Siracusano A，Rigano R，Ortona E，et al.Immunomodulatory mechanisms duringEchinococcusgranulosusinfection[J].Exp Parasitol，2008，119（4）：483－489.

[3]Hosch W，Stojkovic M，Janisch T，et al.MR imaging for diagnosing cysto－biliary fistulas in cystic echinococcosis[J].Eur J Radiol，2008，66（2）：262－267.

[4]杨宏强，彭心宇，张示杰，等.肝内管道CT三维重建在囊性肝包虫病中的应用研究及意义[J].实用放射学杂志，2006，22（5）：543－545.

[5]朱明生，桂东川，赵峰，等.91例肝包虫囊肿退行性变的CT诊断分析[J].中国人兽共患病学报，2009，25（2）：200－201.

[6]彭心宇，张示杰，牛建华，等.肝包虫外膜内完整摘除术[J].中华普通外科杂志，2002，17（9）：529－530.

[7]彭心宇，张示杰，牛建华，等.肝包虫病外科治疗术式选择的新观点（附684例报道）[J].腹部外科，2003，16（1）：19－21.

[8]姜涛，牛建华，彭心宇，等.肝包虫囊壁及周围肝组织中CTGF与TGF－β1的表达[J].石河子大学学报（自然科学版），2007，25（3）：321－326.

[9]吕游，张示杰，彭心宇，等.囊型肝包虫囊周肝细胞“消失”机制的初步研究[J].中国病原生物学杂志，2006，1（5）：359－362.