蚊虫胃血血源鉴定方法

郭绍华，周水森

媒介控制是蚊媒传染病防治的主要措施之一，有效的媒介控制依赖于准确的媒介调查，其中吸血习性调查是媒介调查的重要内容。尤其自Macdonald 1957年提出疟疾流行病学数学模型后，吸血习性已成为决定按蚊传播疟疾能量大小的一个重要参数[1]。通过鉴定蚊虫胃血来源于某种或某个动物（人），可以计算蚊虫的叮人率、人血指数等传播动力学的主要参数，此外，确定了蚊虫胃血来源还有助于了解蚊媒传染病可能的动物保虫宿主范围。本文简要介绍蚊胃血传统血清学鉴定方法，并依据国内外相关研究进展重点综述近年基于DNA的分子鉴定方法，为媒介调查工作提供参考。

1 血清免疫学方法

1.1 沉淀试验 蚊胃血血源鉴定最常用的血清学方法是沉淀试验（precipitin test），其原理是少量浓度较高的特异性抗体与可溶性抗原互相反应生成抗原抗体复合物，并凝集产生肉眼可见的沉淀物。1923年，Bull[2]最早将沉淀试验引入蚊腹血源的鉴定，几经改进，沉淀试验在蚊虫血源鉴定方面发挥了巨大作用。

蚊虫吸血习性沉淀试验主要包括如下5种方法：环状沉淀试验、毛细管沉淀试验、琼脂扩散试验、微孔板法和凝胶表面沉淀试验。最简单也是最常用的是环状沉淀试验，因所需设备少，操作简单、结果易于判读而得到了广泛应用。环状沉淀试验仅需细长小玻璃管，血清放置在试管底部，待检血样轻轻加入管中，两液体交界处出现乳白色环者为阳性反应。另一种较为常用的是毛细管沉淀试验，其原理与环状沉淀试验相似，只是将细玻璃管换成毛细管[3]，交界面出现浑浊表示阳性反应。另外，毛细管沉淀反应在试剂的制备和抗血清的筛选上也进行了一些改进，以提高特异度和灵敏度。这2种方法在大多数调查中仍在使用。其他3种沉淀试验也用于鉴定蚊腹血源。琼脂扩散试验[4]原理是可溶性抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中各自向四周凝胶中扩散，当二者相对应时，即发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。该法简单易操作，并能将结果永久记录，但沉淀线的特征与扩散速度、抗原抗体浓度、纯度等多种参数有关，判读相对繁琐，且其敏感性不如前两种。

微孔板法理论上也是鉴定血源可行的方法，但其应用较为局限，仅见少量文献报道。Tesh[5]称微孔板法鉴定蚊虫腹血来源比毛细管沉淀技术结果更易判读，但需血量大，而蚊虫胃血量有限，故也未在蚊虫胃血鉴定中广泛应用。凝胶表面沉淀试验[6]是将抗血清与琼脂混合，放在玻片上，将待检血样滴加到玻片上（1～3μL），其灵敏度与其他沉淀方法相似。虽然这种方法可能快速检测血源，但从未用于现场标本的检测。

沉淀试验尽管操作简便，但其敏感性和特异性均不高，少量血浆蛋白通过沉淀试验难以检出。此外，检测多重血源特异性较低[7]。

1.2 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）技术，不仅具有高度的敏感性和特异性，而且酶与抗体（或抗原）结合稳定、安全，操作简单，结果判断可用肉眼观察或分光光度计检测等优点，而且适于现场大规模应用，早已应用于各种疾病免疫学诊断和流行病学筛查[8]。胃血鉴定中用到了两种基本的ELISA法：直接ELISA（direct ELISA）和间接 ELISA（indirect ELISA）。间接ELISA，即夹心法，将宿主特异性抗血清加入96孔微量滴定板孵育，用与待测胃血样本同源的免疫球蛋白包被板上的抗－IgG，洗涤，去除非抗原成分，用宿主特异性抗体酶结合物来检测特异性反应。直接ELISA用宿主特异性抗体－酶结合物来检测胃血样本中同源的IgG。两种方法的主要不同在于间接ELISA用抗血清捕捉胃血中的宿主特异性IgG，而直接ELISA用抗体酶结合物结合特异性IgG。采用何种ELISA方法取决于研究目的。Edrissian[9]等用直接ELISA筛查蚊胃血中人血的数量，对伊朗5 000只按蚊进行了人血检测，有经验的技术员可以每周检测1 000只按蚊胃血。Burkot[10]采用间接ELISA法鉴定蚊吸血宿主的种类，在威斯康辛州鉴定出蚊吸食含野生动物在内的16种宿主。间接ELISA技术上比较难，因为必须提前制备各种待检宿主的抗血清。在已知宿主种类范围的前提下间接ELISA较为适用。直接ELISA较适用于调查蚊虫的吸人血状况，目前除了人的抗体－酶结合物可以商业获得外，常见家畜的抗体－酶结合物也可以获得，所以直接ELISA可扩展用于人和 家 畜 血 鉴 定[11]。Chow[12]提 高 了 抗 体 夹 心ELISA的灵敏度，但是因为商业能获取到的抗体酶结合物的种类有限，所以ELISA检测的宿主种类有限。ELISA法弥补了沉淀实验敏感性和特异性较低的局限[13]，但该方法需要前期沉淀试验筛选抗动物的IgG酶结合物，且待检样品要求新鲜血液，这些条件限制了其应用前景。

1.3 被动血凝抑制试验 被动血凝抑制试验（passive hemagglutination inhibition technique，PHI）用于蚊胃血源的鉴定[14－15]可区分近缘宿主。技术原理是未知抗原与已知抗体相结合，并添加红细胞（羊或兔）特异性抗原作指示物。如未知抗原与抗体结合，则红细胞不凝集，产生阳性反应；若未知抗原不与抗体结合，则抗体将与红细胞结合，产生凝集，为阴性反应。与沉淀试验相比，尽管PHI的方法有极高的灵敏度（范围在8～10g蛋白质）和特异性，但它因操作复杂，应用并不广泛[16]。

传统血清学方法需提前制备各种潜在宿主动物的免疫血清，并需消除杂交反应，步骤较为繁琐，且敏感性和特异性均不高[17]，仅能鉴定到不同物种间的血源，难以区分亲缘种或同物种不同个体。

2 分子鉴定方法

分子鉴定方法通过分析血源基因来实现蚊虫胃血来源的鉴定。各种分子鉴定技术因其具有较高的可靠性、特异性和快速、灵敏的特点，可以准确鉴定蚊胃血源到种和个体，胃血血源分析用到的基因有线粒体基因（细胞色素b、细胞色素氧化酶I）、编码核糖体RNA基因和核基因[18]。常用于蚊胃血源鉴定的分子方法有：DNA测序、多重PCR、限制性片段长度多态性PCR（PCR－RFLP）、实时荧光定量PCR （real－time PCR）、异源双链分析、斑点杂交和DNA指纹法。

2.1 DNA测序（DNA sequencing） 采用保守引物扩增各种可能吸血对象的同源性DNA片段以鉴定蚊虫吸血对象。DNA条形码技术（DNA barcod－ing method）正是利用了DNA序列信息。DNA条形码技术简单地说，就是通过使用一个或一些短的DNA基因片段作为条形码来对物种进行快速、准确识别的技术。Miguel[19]采用DNA条形码技术鉴定蚊腹血，充分利用生物条码系统（Barcode of Life Datasystem，BOLD）的公共网络COI基因信息库获取蚊虫可能吸血对象及蚊虫的同源性DNA序列，设计吸血对象保守引物，只扩增吸食的脊椎动物COI基因片段，而不扩增蚊虫自身COI基因片段，获得腹血扩增DNA序列后，将该序列网络查找相应数据库的匹配序列，如GenBank或Barcode of Life Datasystem，从而判定出胃血来源。如果数据库中没有完全匹配的序列，则依据排名靠前的序列将该序列逐步归于相应的门、目、科、属。线粒体基因因拷贝量大，且种间变异大，故在微量蚊胃血血源鉴定中广泛应用。DNA扩增测序另一常用到的片段为线粒体Cytb[20]。对于cytb，种内允许存在不大于1%或2%的序列变异[21]；同样，对于COI，根据Kimura两参数计算序列变异显示种间变异0.25%，属间变异6.8%，科间变异10%～12%[22]。因此，只要序列匹配高于98%～99%就可以进行腹血源的种间鉴定。DNA测序法直观、准确，但费用较高，不适用于大量样本检测。

2.2 多重PCR（multiplex PCR） 当已知可能吸血宿主种类范围，或仅需将吸血对象进行粗略分类时，可以采用多重PCR方法。该方法是根据调查地区常见蚊虫吸血对象的同源性基因序列差异，设计种特异性引物，通过PCR扩增，获取大小不同的片段，与预期片段大小比较，判定血源。Kent ＆Norris[23]在非洲根据研究村子按蚊常见吸血对象（人、牛、羊、猪和犬）的线粒体DNA－cytb序列差异设计种特异性引物，以保守的反向引物和动物特异性引物采用多重PCR扩增不同动物种特异片段，在凝胶电泳上依据条带大小直观判断蚊胃血来源。该法简单易行，适用于具体地区现场蚊虫吸血习性调查[24－25]。多重PCR鉴别关键在于引物的设计与选择，特异性引物要求能准确区分不同物种，保守引物在使用前需要对各类脊椎动物进行预检测，以防交叉反应。

2.3 限制性片段长度多态性PCR 当直接测序法太贵或无法测序、特异性PCR引物无法扩增出预期的特异性条带或种间的基本序列差异不足以设计可靠的种特异性引物时，可以采用限制性片段长度多态性 PCR（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法来鉴定蚊胃血源。Ngo[26]根据当地常见鸟类的cytb设计简并引物扩增同源的DNA片段，然后将扩增片段用Hae III和Dde I限制性内切酶酶切产生特异性条带来鉴定蚊胃血源鸟类宿主。T－RFLP（末端限制性片段长度多态性）由RFLP发展而来，与RFLP不同之处在于每条引物末端进行荧光染料标记。2005年Meece[27]采用TRFLP法对蚊虫胃血69种脊椎动物中的67种进行种间鉴定，采用保守引物扩增特异片段（如cytb片段），在每条引物末端进行荧光染料标记，PCR扩增产物被AciI，AluI，HaeIII和RsaI 4种限制性内切酶消化，毛细管电泳呈现8种不同大小和颜色的DNA片段，然后通过查询网络数据库来分析TRFLP图谱。缺点是该方法需要克隆基因作探针，工作量较大，且DNA用量和纯度都要求较高。

2.4 实时荧光定量PCR 在腹血DNA量少且部分消化的情况下，实时荧光定量PCR（real－time PCR）技术在胃血鉴定方面比传统PCR效率明显提高[28]。该技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号输出实时监测整个PCR过程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析[29]。采用基于cytb的358bp片段的real time TaqMan PCR方法鉴定吸食土著澳大利亚哺乳动物的蚊虫的腹血，检测灵敏。该法也用于跳蚤腹血的常见8种吸血宿主的鉴定[30]，该法检测灵敏度和特异度均高，能够检出1pg的胃血DNA。

实时荧光定量PCR特异性和敏感性高、结果客观准确、无需后续电泳检测是该技术的优点，但探针标记成本较高且需要较强的专业知识，实时PCR仪价格昂贵，仪器操作也需要专业培训，这些条件限制了其现场应用。

2.5 异源双链分析 异源双链分析（Heteroduplex analysis，HA）是基于DNA链变性和退火形成同源和异源双链DNA分子，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，同源双链和异源双链的泳动性不同。该技术在生物医学领域用来检测人基因中引起疾病的突变[31]。

在蚊虫胃血鉴定中采用来源于同种或亲缘关系很近的物种单倍体cytb基因作为检测基因，与每个待检样本混合，PCR反应，产生同源双链和异源双链DNA分子，因此异源双链由两种不同脊椎动物物种的退火PCR产物组成[32]。因此，只要具备已知来源DNA、脊椎动物种特异性引物和一个或多个核苷酸差异，该方法可将蚊胃血血源鉴定到种一级[33－35]。该技术结果可重复性强，但是操作技术要求高，不易掌握。

2.6 斑点杂交 斑点杂交（dot blot）是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜，NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。

生物素标记的探针区分人、狗、牛、猪、鼠和山羊的DNA，提取将以上人和动物的DNA高温变性后点加在硝酸纤维素膜上，用放射性探针进行杂交，根据杂交反应和强度来区分不同的吸血对象来源，但该方法在人和日本猕猴间出现交叉反应[36]，另外，生物素标记因具备放射性，限制了其在现场中的应用；Koella.[37]等进行了改进，采用非同素探针代替放射性生物素探针，改进后的方法同样可以区分不同吸血来源宿主，检测发现同域分布的An.Quadrimaculatus A比B和C1更倾向于吸食人血。

2.7 DNA指纹法 上述血源鉴定方法均不能鉴定到种群内的不同个体。基于微卫星技术的DNA图谱法，也称DNA指纹法（DNA finger print）已被用来区分不同个体脊椎动物宿主独特的基因型。

微卫星标记（microsatellite）或短串联重复序列（STR）存在于大多数真核生物的基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。通过扩增和比对从蚊虫和其相应宿主血液中提取的基因组DNA微卫星序列，待测图谱与可能吸血的相应宿主个体的图谱进行比较、匹配，不仅为蚊虫的宿主选择性研究提供依据，也为个体患蚊媒病的风险评估提供了依据。为产生重复性指纹，需要从胃血中提取足量完整高分子量的DNA和能区分宿主的高辨识度的分子标记。

Coulson[38]和Gokool[39]采用扩增蚊腹中的人血重复DNA序列片段来寻找宿主个体，成功获取鉴定性微卫星序列，对应吸血的对象。Chow－Shaffer[40]将人高度多态的STR位点引入鉴定，银染丙烯酰胺变性凝胶，放射自显影观察条带，然后比对蚊胃血DNA和人颊部刮取样本DNA。Scott[41]采用DNA指纹法鉴定肯尼亚传疟媒介的腹血，该方法大大促进了对蚊虫对不同人个体、不同年龄组嗜血习性的流行病学研究。

尽管目前所有的工作都围绕银染或放射标记凝胶显示微卫星等位基因大小，该技术也可采用荧光标记引物自动化操作，使用软件包获取微卫星基因型和等位基因大小。

3 展 望

目前传统血清学方法鉴定蚊胃血源仍在使用，但需提前制备各种潜在宿主动物的免疫血清，并需消除杂交反应，步骤较为繁琐，且敏感性和特异性均不高，已难以满足精确鉴定蚊胃血源的需求。基于基因的分子生物学鉴定方法已被证实非常有效，分子生物学鉴定蚊胃血血源依赖于准确的DNA序列，随着基因序列库的日趋完善，该法显示出巨大的优势，已逐步应用于现场检测，有可能迅速取代传统血清学方法成为鉴定蚊虫胃血血源的常规方法。

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