低体积PCR扩增用于单细胞分离和检验

韩俊萍，李彩霞，严 红，朱 典，李艮平，胡 兰

（1.中国人民公安大学，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038；3.法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038；4.重庆医科大学，重庆 400016）

低体积PCR扩增用于单细胞分离和检验

韩俊萍1，李彩霞2，3，严 红2，朱 典4，李艮平4，胡 兰2，3

（1.中国人民公安大学，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038；3.法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038；4.重庆医科大学，重庆 400016）

目的 优化在单细胞分离检验中应用0.2mL试管做低体积扩增载体的最佳反应条件。 方法 制备理想口腔上皮细胞悬液，用0.2mL试管分别收集捕获到的5、10个细胞，设置蛋白酶K添加、PCR反应金牌酶用量、循环次数3组条件，用Identifiler®Plus试剂盒进行复合扩增，比较各组的检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增情况。 结果 用0.2mL试管做低体积扩增中，加蛋白酶K裂解、PCR反应金牌酶0.4μL、PCR反应32个循环，这3个条件的检出率较高，等位基因丢失率较低。 结论 在单细胞分离检验中采用0.2mL试管进行低体积扩增，可以作为芯片-低体积扩增的有效补充手段。

法医遗传学；核酸扩增技术；单细胞

混合生物检材的DNA分型问题是法医实际检案的难题之一，而近些年来发展起来的单细胞分离检验技术[1]是实现混合样品分离检验的有效方法之一。有研究建立了单细胞分离检验技术，其中的芯片-低体积扩增技术使整个平台的灵敏度显著提高[2-6]。但在实际应用中发现，低体积扩增技术使用的扩增玻片采用开放设计的模式，对实验环境和操作的要求较高，并且需要单独购置扩增仪器，增加了成本，不利于该技术的推广和应用。因此，本研究旨在探索试管中进行低体积扩增的可行性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

理想口腔拭子（健康志愿者提供）1枚。

Identifier®Plus试剂盒（含Control DNA 9947A）、9700型热循环仪、3130型遗传分析仪均购自美国AB公司，Olympus倒置显微镜、TransferMan NK2显微操作仪、80 μm毛细管玻璃吸针均购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞悬液的制备

取1枚口腔拭子放入加有1mL无菌去离子水的1.5mL试管中，晃动拭子几次，使其上的细胞充分脱落，弃去拭子，振荡离心管，混匀液体。

1.2.2 细胞捕获

参照文献[4]显微捕获操作步骤进行细胞捕获。

1.2.3 考察蛋白酶K的作用

取2组0.2mL试管，每组16个。第一组每管加1.2μL的灭菌水，第二组每管加1.2μL的蛋白酶K（质量浓度为0.4mg/mL），每组均加入捕获的细胞5、10个，各8管，以离心半径5 cm，8 000 r/min，离心1 min，加入3.5μL矿物油。将第二组放于9700型热循环仪在56℃ 1h、99℃ 10min条件下裂解变性。第一组不裂解。之后，2组各管均加1.2μL PCR反应液（含金牌酶0.4μL），用Identifiler®Plus试剂盒进行扩增。

扩增程序为：95℃ 11min；94℃ 20s，59℃ 3min，30个循环；60℃延伸40min；4℃保存。所有产物均在3130型遗传分析仪进行检测。每组均设有阴性和9947A阳性对照。

1.2.4 PCR反应金牌酶用量的优化

取2组0.2mL试管，每组16个，每组均加入捕获的细胞5、10个，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2μL PCR反应液，其中第一组含金牌酶0.2μL，第二组含金牌酶0.4μL，扩增程序及其他步骤均同上。

1.2.5 PCR循环次数的优化

取3组0.2 mL试管，每组16个，每组均加入捕获的细胞5、10个，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2 μL PCR反应液（含金牌酶0.4 μL），第一组扩增时循环30次，第二组循环32次，第三组循环34次，其他步骤均同上。

1.2.6 数据分析

所得DNA检测图谱均与已知分型结果比对，获得13个基因座以上正确分型且各等位基因峰高大于50RFU为有效分型结果。每个条件下的8次实验结果按照同一基因座出现该峰5次以上的原则进行结果综合，综合结果与标准分型比对。所得数据采用四格表χ2检验进行统计学分析。

2 结 果

2.1 蛋白酶K对实验结果的影响

在细胞数目相同的情况下，添加蛋白酶K的检出率（有效分型次数/8次实验）、非特异性扩增位点数（出现非特异性扩增的位点/16个位点×8次实验）、等位基因丢失率（等位基因丢失条带总数/预计等位基因总条带）结果见表1。由表1可知，添加蛋白酶K的检出率高于不加蛋白酶K，等位基因丢失率也低于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）。5个和10个细胞的综合结果与标准分型一致。

表1 是否加蛋白酶K的实验结果（n=8，%）

2.2 PCR反应中金牌酶用量的优化

当细胞数目相同时，PCR反应中金牌酶加0.4μL的非特异性扩增位点数和等位基因丢失率均低于加0.2μL，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组的综合结果均与标准分型一致。结果见表2。

表2 PCR反应中金牌酶不同用量的实验结果（n=8，%）

2.3 对PCR循环次数的优化

当细胞数目相同时，3组循环数的等位基因丢失率比较，PCR循环32次等位基因丢失率明显低于循环次数为30和34，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组的综合结果均与标准分型一致。结果见表3。

表3 循环次数的实验结果 （n=8，%）

2.4 不同细胞数的检出率和等位基因丢失率的比较

在加入蛋白酶K、PCR反应加金牌酶0.4 μL、循环次数为32的条件下，5个细胞的检出率是75%，等位基因丢失率12.05%，10个细胞可以获得稳定的完整分型，二者等位基因丢失率的差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

本实验使用显微操作方法捕获所需数目的口腔上皮细胞，置于0.2 mL试管中，裂解时在管中加入3.5μL矿物油封闭，以防止因温度过高蛋白酶K蒸发导致裂解不完全，同时也有效避免了DNA量的损失。实验中除严格控制污染外，同时设置阴性和9947A阳性对照，结果均显示正确，说明本实验未受到外源性DNA的污染。

由本实验结果可以看出，加蛋白酶K裂解的实验组要优于不加蛋白酶K，而且增加PCR反应液中金牌酶量以及循环次数，减少了等位基因丢失，提高检测灵敏度。但当循环数增加至34次时，非特异性扩增增加同时等位基因丢失增多，这是由于循环数增多，小片段优先扩增，大片段的扩增产物少，使得等位基因丢失反而增多，故循环数不是越多越好。常规的PCR反应体系中金牌酶加0.2 μL，本实验中增加至0.4μL，其作用是在小体系下酶量加倍可以增大反应效率，减少等位基因片段的丢失。综合以上3组实验结果，优化出2μL体系扩增条件为加蛋白酶K裂解，循环32次，反应液中金牌酶量加0.4μL。

在优化出的实验条件下，10个细胞的检出率达100%，等位基因丢失率明显低于5细胞，虽然5个细胞的检出率达不到100%，但是综合8次实验的结果最终可以获得完整的分型，因此，用试管做2 μL扩增，其灵敏度也较高，能满足微量检材扩增的要求。

前期研究表明，使用显微操作技术联合AmpliGrid芯片-低体积扩增进行单细胞分离检验，3个口腔上皮细胞就能得到完整的Identifiler和Minifiler这两种试剂盒的分型图谱[4-5]。AmpliGrid 1 μL体系显著提高了检测的灵敏度和检出率，对研究微量和超微量检材具有重要意义。但其也存在一些不足，首先AmpliGrid微量反应玻片价格昂贵，增加了检测成本；其次，该玻片48个反应位点是开放性的，如果一次实验未用完，第二次使用时存在污染的可能，对低体积扩增影响很大；再次，玻片上由于操作技术或其他原因在裂解和扩增时容易产生气泡爆掉，最终得不到任何实验结果，即稳定性不太好。基于上述不足，本研究优化了试管作为2μL扩增体系。通过实验发现，该体系的灵敏度和检出率虽然不如用芯片做低体积扩增体系高，但是其成本远低于1μL体系，不需要额外购置扩增仪器，对操作技巧要求低，可以作为低体积扩增技术的有效补充手段之一。

[1]Findlay I，Taylor A，Quirke P，et al.DNA fingerprinting from single cells[J].Nature，1997，389（6651）：555-556.

[2]张健，胡兰，张惠芹，等.利用LCM技术从生物检材中提取单个细胞[J].中国人民公安大学学报（自然科学版），2005，（1）：14-17.

[3]李鑫，胡兰，郭红玲，等.显微操作法提取混合斑中精子细胞方法的探讨[J].中国法医学杂志，2006，21（5）：263-265.

[4]亓冰，李彩霞，涂政，等.单细胞显微捕获技术联合LVPCR系统在法医学中的应用[J].国际遗传学杂志，2009，32（2）：84-88.

[5]苏芹，严红，李彩霞，等.MiniFiler试剂盒进行微量细胞STR分型可行性探讨[J].中国法医学杂志，2008，23（5）：330-332.

[6]黄江平，李彩霞，亓冰，等.显微捕获技术结合低体积扩增技术在混合唾液斑检验中的应用[J].吉林公安高等专科学校学报，2010，（1）：49-54.

2011-12-05）

（本文编辑：李成涛）

Low Volume Amplification in Single Cell Separation and Inspection

HAN Jun-ping1,LI Cai-xia2,3,YAN Hong2,ZHU Dian4,LI Gen-ping4,HU Lan2,3
（1.Chinese People’s Public Security University,Beijing 100038,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,P.R.China,Beijing 100038,China;3.Key laboratory of Forensic Genetics,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China;4.Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）

Objective To establish optimal amplification conditions with the application of 0.2mL test tube in single cell separation and inspection.Methods Oral epithelium cell suspension was prepared.Five or ten cells were collected with 0.2 mL test tube.Then DNA were amplified with Identifiler®Plus kit in three different conditions in which the proteinase K addition,gold enzyme concentration in PCR reaction, and PCR reaction cycles were adjusted separately.Finally the detection rate,allelic dropout rate and artificial alleles were compared among the groups.Results In these 3 different conditions：addition of proteinase K,addition of 0.4 μL gold enzyme in PCR reaction,and use of 32 cycles,the detection rate was higher and allelic dropout rate was lower than the other conditions.Conclusion In single cell separation and inspection,the usage of 0.2mL test tube could be an effective supplement to chip-low volume amplification.

forensic genetics;nucleic acid amplification techniques;single cell

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.012

1004-5619（2012）02-0123-03

韩俊萍（1986—），女，山西太原人，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究；E-mail：pgww19861025@163.com

胡兰，女，博士，主任法医师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：hulan328@yahoo.com