氯胺酮与酒精对小鼠学习记忆行为的影响

杨美玉，丁 飞，蒋小岗，吴勰星，顾振纶，郭次仪，卞士中

（1.苏州大学医学部法医学系 苏州大学司法鉴定所，江苏 苏州 215123；2.上海市公安局宝山分局刑事科学研究所，上海 宝山 201900；3.苏州中药研究所，江苏 苏州 215006；4.苏州大学医学部临床医学系，江苏 苏州 215123）

氯胺酮与酒精对小鼠学习记忆行为的影响

杨美玉1，3，丁 飞2，蒋小岗3，吴勰星4，顾振纶3，郭次仪3，卞士中1

（1.苏州大学医学部法医学系 苏州大学司法鉴定所，江苏 苏州 215123；2.上海市公安局宝山分局刑事科学研究所，上海 宝山 201900；3.苏州中药研究所，江苏 苏州 215006；4.苏州大学医学部临床医学系，江苏 苏州 215123）

目的 研究氯胺酮与酒精对小鼠学习记忆的行为学及相关神经递质的影响。 方法 40只小鼠分为4组：对照组、氯胺酮组、酒精组、氯胺酮酒精联合给药组，每组10只。氯胺酮和酒精分别采用腹腔注射和灌胃给药的方式，1次/d，连续14d。通过跳台和水迷宫实验检测各组小鼠的学习记忆能力，通过测定小鼠大脑组织中乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）和5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）的含量初步探讨氯胺酮与酒精对小鼠学习记忆的影响机制。 结果 （1）跳台实验：给药组小鼠均出现潜伏期缩短，错误次数增多（P＜0.05）。与单独给药相比，联合给药组错误次数显著增加。（2）水迷宫实验：给药组小鼠潜伏期显著增加（P＜0.05），平台所在象限活动时间明显缩短（P＜0.05），穿台次数显著减少（P＜0.05）。（3）生化指标测定：各给药组ACh和5-HT含量明显下降，且联合给药组较单独给药组下降更为明显（P＜0.05）。 结论 氯胺酮和酒精对小鼠学习记忆行为的抑制具有协同作用，这可能与共同抑制5-HT和ACh含量的降低有关。

法医毒理学；氯胺酮；酒精；学习；记忆；小鼠

氯胺酮为苯环己哌啶（phencylidine，PCP）衍生物，是非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体拮抗剂，作为一种静脉麻醉药，已在临床应用多年。研究认为氯胺酮可介导精神分裂样症状[1]和认知障碍[2]。重复注射氯胺酮可使大鼠海马内NMDA受体数量下降和NMDA受体亚单位的改变，NMDA受体数量和结构组成的改变可严重损害包括学习记忆在内的中枢神经系统功能[3]。目前对氯胺酮致认知障碍的研究多集中于临床麻醉，而就其基于亚急性中毒或成瘾性的研究较少。本研究以小鼠为实验对象，观察氯胺酮与酒精对小鼠学习记忆行为学改变及相关神经递质的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR小鼠，雄性，体质量25～30 g，由苏州大学实验动物中心提供。实验前小鼠适应性饲养3d，维持室温（22±1）℃，在整个实验过程中小鼠自由饮水和进食。

1.2 药品和仪器

盐酸氯胺酮注射液（国药准字H32022820，批号KH071004，2mL：0.1 g）购自江苏恒瑞医药公司，56%红星二锅头酒购自北京红星股份有限公司，乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA试剂盒购自美国Ramp;D公司。

Morris水迷宫装置（上海移数信息科技有限公司），STT-2跳台仪（中国医学科学院药物研究所）。

1.3 模型制备与给药[4]

实验设正常对照组、氯胺酮组、酒精组、联合给药组共4组。给药方式为：对照组以生理盐水腹腔注射＋生理盐水灌胃，酒精组以生理盐水腹腔注射＋酒精灌胃，氯胺酮组以氯胺酮腹腔注射＋生理盐水灌胃，联合给药组以氯胺酮腹腔注射＋酒精灌胃。腹腔注射量：生理盐水0.01 mL/g，氯胺酮0.05 mg/g，每天1次，连续14 d；灌胃剂量：生理盐水、酒精（红星二锅头稀释至20%）[6]0.01mL/g，每天1次，连续14d。各组小鼠每天9：00给药。

1.4 行为学实验[7]

1.4.1 跳台实验

用药前一天先将小鼠放入反应箱内适应3 min后，通电电击。训练时跳台潜伏期大于180s者弃去不用。选定40只小鼠，记录小鼠5min内第1次从平台跳下的时间（潜伏期）和跳下的次数（错误次数），以错误次数作为基础成绩将小鼠分成3组，使各组小鼠智力水平接近。然后按分层随机区组设计[5]，将小鼠分为对照组、酒精组、氯胺酮组和联合给药组，每组10只。给药14d后重新测试并记录各组小鼠跳台实验潜伏期和错误次数，比较不同组间小鼠记忆成绩的差异。

1.4.2 Morris水迷宫实验

各组小鼠于给药7d后开始水迷宫实验，并继续给药至第14天。

1.4.2.1 定位航行实验

给药至第7天将4组小鼠均放入不含平台的水池中自由游泳2min，使其熟悉迷宫环境。将水池分为4个象限，平台所在位置为第2象限。从第8天开始实验。实验时按照第1、2、3、4象限的顺序将小鼠面向并靠近池壁放入水中，计算机软件系统记录小鼠从入水到爬上平台的游泳时间，即逃避潜伏期。超过120s找不到平台，可引导其找到平台。全部小鼠完成1个象限实验后再进行下1个象限的测试，直至完成4个象限的测试，计算4个象限的平均潜伏期。每天在一个固定的时间段内让每只小鼠按相同象限顺序依次进行4个象限的寻找隐匿平台的游戏训练一次，连续6d。

1.4.2.2 空间探索实验

第14天上午进行空间探索实验。测量120s内：（1）动物在目标象限（原平台所在象限）和其他各象限的游泳时间（以占120s的百分比计算）；（2）穿越目标（原平台位置）次数。

1.5 脑组织ACh和5-HT的生化测定

所有小鼠于行为学实验结束后断头取大脑组织（匀浆后取上清液置于-80℃冰箱内保存），组织中ACh和5-HT含量测定按试剂盒说明书进行。

1.6 数据处理

2 结 果

2.1 跳台实验

连续14d给予酒精、氯胺酮及联合给药后，可明显引起小鼠跳台作业障碍，表现为错误次数增多、潜伏期缩短、认知记忆力显著下降。各组间方差分析显示：潜伏期（F=4.159，P=0.013），错误次数（F=5.786，P= 0.003）。两两比较显示，各给药组与对照组相比，潜伏期显著缩短、错误次数增多，联合给药组较氯胺酮、酒精组潜伏期更短、错误次数显著增加（P＜0.05）。给药前的基础成绩在各组间比较差异无统计学意义（表1）。

2.2 水迷宫实验

2.2.1 定位航行实验

连续给药7d后，各组小鼠寻找平台的时间（逃避潜伏期）随训练次数的增加逐渐缩短。方差分析显示，给药第8天，联合给药组小鼠逃避潜伏期较对照组延长，酒精组、氯胺酮组与对照组比较，差异无统计学意义，第9天起给药组潜伏期均较对照组延长，第13天各组小鼠逃避潜伏期组间差异显著（F=8.520，P=0.000）。两两比较显示，给药第10、11、13天，联合给药组较酒精组、氯胺酮组潜伏期显著增加（P＜0.05，见表2）。各组小鼠水迷宫寻找平台轨迹图显示，正常组小鼠可快速地找到隐匿平台，路线清晰，路程简短；而给药组寻找隐匿平台轨迹则呈现出不同程度的紊乱，与正常组相比路程明显变长，且联合给药组变化更为显著（图1）。

表1 不同药物对小鼠跳台实验结果的影响 （n=10，±s）

表1 不同药物对小鼠跳台实验结果的影响 （n=10，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与联合给药组比较，P＜0.05

组别 给药前 给药后潜伏期/s 错误次数 潜伏期/s 错误次数对照 126.54±126.64 2.36±1.63 170.70±137.07 0.90±1.19酒精 113.36±127.41 2.72±1.84 82.70±115.811）2） 2.20±1.401）2）氯胺酮 121.36±117.35 2.27±1.73 72.00±97.421）2） 2.22±1.301）2）联合给药 134.91±103.14 2.36±2.24 33.78±40.981） 3.44±1.331）

表2 不同药物对小鼠逃避潜伏期的影响 （n=10，±s，s）

表2 不同药物对小鼠逃避潜伏期的影响 （n=10，±s，s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与联合给药组比较，P＜0.05

组别 8d 9d 10d 11d 12d 13d对照 79.20±21.59 64.06±19.08 61.31±15.42 51.58±19.07 50.12±16.15 38.75±21.38酒精 89.26±17.92 80.83±20.941） 77.04±14.231）2） 72.51±19.511）2） 68.41±17.781） 62.18±19.181）2）氯胺酮 91.55±19.97 79.32±19.411）2） 73.69±16.341）2） 71.28±15.481）2） 67.20±16.111） 65.73±11.481）2）联合给药 98.85±16.851） 93.57±17.371） 89.04±19.091） 86.07±16.881） 79.26±29.011） 76.73±16.491）

2.2.2 空间探索实验

各组小鼠在平台所在象限（第2象限）游泳时间，与对照组相比，给药组在目标象限活动时间比明显减少，且以联合给药组时间最短（F=4.725，P= 0.045），说明各种给药对小鼠空间记忆能力有破坏作用（表3）。

小鼠穿台次数各组间方差分析见表3，显示各给药组穿台次数逐渐降低（F=10.079，P=0.000）。

表3 不同药物对小鼠空间探索实验结果（n=10，±s，%）

表3 不同药物对小鼠空间探索实验结果（n=10，±s，%）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与联合给药组比较，P＜0.05

组别 原平台所在象限游泳时间 穿台次数对照 36.86±8.93 4.13±0.78酒精 30.05±4.181） 2.75±0.661）2）氯胺酮 30.91±4.671） 2.50±1.001）联合给药 26.27±11.581） 2.00±0.501）

2.3 脑组织中ACh和5-HT的生化测定

方差分析显示各给药组小鼠脑组织中ACh含量均较对照组降低，组间差异有统计学意义（F=11.892，P=0.000）。两两比较显示，联合给药组ACh含量较氯胺酮组显著降低（表4）。方差分析显示，5-HT含量在组间差异有统计学意义（F=23.268，P=0.000），两两比较显示，联合给药组5-HT含量较酒精组显著降低（P＜0.05，见表4）。

表4 不同药物对小鼠脑组织中ACh和5-HT含量的影响（n=10，±s）

表4 不同药物对小鼠脑组织中ACh和5-HT含量的影响（n=10，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与联合给药组比较，P＜0.05

组别 ACh/（μg/g） 5-HT/（pg/g）对照 2262.47±95.41 167.59±12.69酒精 1906.86±180.841） 155.27±9.651）2）氯胺酮 1945.70±173.641）2） 142.53±11.621）联合给药 1777.31±119.581） 133.20±8.801）

3 讨 论

学习和记忆是动物和人赖以生存的重要脑功能之一，二者相互联系，并受递质和神经肽的调节。阿片肽、胆碱能神经递质、儿茶酚胺类神经递质、肾上腺糖皮质激素、NMDA、GABA、NO、P物质、血管加压素、钙基因相关肽、神经营养因子等均可影响学习或记忆过程，直接或通过相互作用来影响学习和记忆的某个环节或者方面，从而参与对学习记忆的调节[8]。

氯胺酮是NMDA受体的非特异性阻断剂。其作用机制复杂，涉及NMDA受体、阿片类受体、单胺类受体、乙酰胆碱受体和电压门控钙通道受体等。麻醉剂量的氯胺酮可导致认知功能障碍[9-10]。目前研究认为，麻醉剂量的氯胺酮通过阻断NMDA受体抑制学习记忆能力[11-12]，NMDA依赖性的突触可塑性是海马区学习记忆形成的重要机制[13]；同时α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR）介导的快速兴奋性突触传递和整个大脑NMDA受体活性依赖的调控起到了关键作用[14]。这两类受体对神经元突触长时程增强的产生、维持和学习记忆功能至关重要。

早期研究[15]表明，酒精在较低浓度时就可对NMDA受体的一个亚型起作用，以某种方式改变该受体亚型之间的相互配合，从而使得谷氨酸利用受体进行的信号传递受到破坏，这是一种突触后调节。此外，海马中的胆碱能受体与学习记忆密切相关，空间学习记忆能力依赖于海马的ACh，ACh水平高则此能力强。酒精会抑制多个脑区内的中枢胆碱能通路，有报道注射阿片受体拮抗药纳洛酮能明显增加大鼠海马内ACh的释放使脑内ACh水平升高，从而提高学习记忆能力[16]。

文献报道，酒精对神经系统的损伤很可能与其初级代谢产物乙醛和单胺类神经递质发生的缩合反应有关[17]。其中，多巴胺（DA）、5-HT可与乙醛缩合成内源性神经毒性物质，很可能参与了神经通路的退行性病变过程。目前，研究者主要从纹状体和海马区突触界面结构的变化、长时程突触抑制以及一些胆碱能神经递质等的变化方面来研究其对于学习记忆的损伤。

本研究选用学习记忆经典实验即跳台实验和Morris水迷宫对各组实验小鼠进行行为学测试。行为学实验结果显示，在跳台实验中，给药后对照组小鼠无明显异常反应，酒精组小鼠跳台潜伏期明显缩短，跳台错误次数显著增加（P＜0.05）。Morris水迷宫实验结果表明，与对照组比较，酒精组小鼠逃避潜伏期从第9天开始明显增加（P＜0.05）；小鼠在平台所在象限（第2象限）游泳时间、穿台次数与对照组相比明显减小（P＜0.05），说明实验用酒精剂量对小鼠空间记忆能力有破坏作用，给小鼠灌酒引起的学习记忆障碍造模成功。氯胺酮组小鼠与对照组比较，给药后跳台潜伏期缩短，跳台错误次数显著增加（P＜0.05）；Morris水迷宫实验结果表明，从第9天开始逃避潜伏期较对照组明显延长（P＜0.05），小鼠在平台所在象限游泳时间与对照组相比明显减少，穿台次数明显降低（P＜0.05）。联合给药组小鼠在跳台实验中，与酒精、氯胺酮、对照组相比，潜伏期减少、错误次数增加（P＜0.05）；Morris水迷宫实验结果表明，在第10、11、13天逃避潜伏期较酒精组和氯胺酮组明显增加（P＜0.05）；空间探索实验结果表明，联合给药组小鼠在平台所在象限游泳时间较对照组明显变少，穿台次数显著降低（P＜0.05）。

小鼠脑组织中生化指标测定结果表明：各给药组ACh、5-HT含量与对照组比较，均明显下降（P＜0.05）；联合给药组ACh含量较氯胺酮组明显减少，5-HT含量较酒精组明显减少（P＜0.05）。这可能与乙酰胆碱分子合成减少、结构及功能异常有关，乙酰胆碱对下游信号转导通路水平的调控，是胆碱能神经系统调节认知功能的重要机制，因此需要进一步的分子学实验进行研究验证。

综上所述，氯胺酮或酒精单独给药14天后均可造成小鼠学习记忆功能障碍，氯胺酮和酒精联合给药比单独给药更能使小鼠学习记忆减退，说明氯胺酮对于酒精引起的小鼠学习记忆行为的抑制具有一定的协同作用，其机制可能是通过NMDA受体、乙酰胆碱受体和单胺类受体等途径的协同而增强了遗忘作用。

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2011-08-06）

（本文编辑：张钦廷）

Effects of Ketamine and Alcohol on Learning and Memory Impairment in Mice

YANG Mei-yu1,3,DING Fei2,JIANG Xiao-gang3,WU Xie-xing4,GU Zhen-lun3,GUO Ci-yi3,BIAN Shi-zhong1
（1.Institute of Forensic Science of Soochow University,Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Institute of Criminal Science and Technology,Baoshan Branch of Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 201900,China;3.Suzhou Institute of Chinese Materia Medical,Suzhou 215006,China;4.Department of Clinical Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China）

Objective To study the effects of ketamine and alcohol on learning and memory in mice and its possible mechanism.Methods Forty mice were divided into 4 groups：normal control group,ketamine group,alcohol group,and alcohol plus ketamine group.Ketamine and alcohol were given by intraperitoneal injection and intragastric administration,respectively,1 time per day,for 14 days.The ability of learning and memory in mice was tested by the method of step-down and Morris water maze.Acetylcholine（ACh）and 5-hydroxy tryptamine（5-HT）in mice brain tissue were analyzed for the possible mechanism.Results（1）Step-down：The treatment groups lessened the latency and added wrong times（P＜0.05）.The number of errors in the combined treatment group significantly increased comparing with the single drug treatment group（P＜0.05）.（2）Morris water-maze：The treatment groups prolonged the latency（P＜0.05）,reduced the target quadrant activity time significantly（P＜0.05）,and decreased the numbers of crossing the former platform significantly（P＜0.05）.（3）Biochemical index determination：The concentrations of ACh and 5-HT in treatment groups decreased significantly（P＜0.05）,showed a more decreasement comparing with the single drug treatment group.Conclusion Ketamine has a synergistic effect with alcohol on learning and memory impairment in mice,which may be related to the common inhibitive effect on the ACh and 5-HT.

forensic toxicology;ketamine;alcohol;learning;memory;mice

DF795.3

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.010

1004-5619（2012）02-0115-05

杨美玉（1984—），女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事法医毒理学研究；E-mail：meiyu0307@163.com

卞士中，男，主任法医师，副教授，硕士研究生导师，主要从事法医毒理学研究；E-mail：bianshizhong@suda.edu.cn