人类岩藻糖基转移酶5特异性分布及其在精细胞的表达与定位

李冯锐，周懿舒，朱兰卉，崔洪刚，王保捷，丁 梅，庞 灏

（1.中国医科大学法医学院法医血清教研室，辽宁 沈阳 110001；2.包头医学院法医学系，内蒙古 包头014060）

人类岩藻糖基转移酶5特异性分布及其在精细胞的表达与定位

李冯锐1，2，周懿舒1，朱兰卉1，崔洪刚1，王保捷1，丁 梅1，庞 灏1

（1.中国医科大学法医学院法医血清教研室，辽宁 沈阳 110001；2.包头医学院法医学系，内蒙古 包头014060）

目的 研究人类岩藻糖基转移酶5（fucosyltransferase 5，FUT5）的特异性分布及在精细胞的表达与定位。 方法 收集健康志愿者的精液（分离精细胞并提取精细胞膜蛋白）、阴道拭子、唾液及静脉血，应用免疫印迹方法检测FUT5在人类精细胞膜、精浆、阴道液、唾液及血清中的表达量，采用免疫荧光技术检测FUT5在精细胞中的表达与定位。 结果 免疫印迹方法结果显示FUT5在精细胞膜及血清中有较高表达，但在精浆、阴道液及唾液中未被检测到。免疫荧光实验结果显示FUT5主要存在于精细胞头部。表明人类精细胞膜存在一定表达量的特异性FUT5，可采用抗原-抗体反应分离精液和阴道液混合斑中的精细胞。结论 人类FUT5表现出分布特异性，可应用到法医学性犯罪案件中混合斑的鉴定。

法医遗传学；精细胞；特异性；岩藻糖基转移酶类

人类岩藻糖基转移酶 5（fucosyltransferase 5，FUT5）是较早用于鉴定的人类岩藻糖基转移酶家族成员之一[1]，尽管对其功能及遗传多态性的研究较为深入[2]，但是至今为止其准确的分布特异性尚未完全明了。近年来的研究显示，精细胞存在着多种特异性蛋白[3-5]，这些蛋白在精子与卵细胞特异性结合过程中发挥着重要的作用，其中的FUT5就是新近在人类精子中发现的一种膜内镶嵌糖蛋白，作为膜蛋白的FUT5可能赋予精子特有的生物学功能，并且FUT5可作为选择性受体，协同完成精卵的识别与结合[6]。因此，存在于精细胞膜上的FUT5可考虑用蛋白免疫印迹、细胞免疫荧光等方法鉴定其特异性分布，以期应用于法医学精斑的确证试验。同时根据精细胞中存在的FUT5与其对应的蛋白质相互作用，以及与对应抗体结合的特性，可考虑进行精液与阴道液混合斑中精细胞的分离，以期应用于法医学的个人识别。为此，本研究对FUT5的特异性分布及其在精细胞的表达和定位进行研究，为法医学混合斑的鉴定提供新思路。

1 材料与方法

1.1 样本

分别收集健康志愿者精液15例（精液常规参数正常），近期无性生活的健康志愿者阴道拭子5例，健康人枸橼酸钠抗凝静脉血5例，健康人自然分泌的唾液5例。

1.2 试剂与仪器

RIPA裂解液（强）、Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天生物技术公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购自美国Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；FUT5抗体 （sc-14872）、Dylight 488荧光标记二抗、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruz公司。

DM4000荧光显微镜（德国Leica公司），Image Quant RT ECL凝胶成像分析系统（美国GE Image Quant公司），CF16RXII高速冷冻离心机（日本Hitachi公司），SCIENTZ-IIE超声波细胞粉碎机（中国新芝科技公司）。

1.3 样本处理

15份精液样本均各取 3 mL置于清洁无菌杯中，于37℃水浴使其液化，4℃下，以15 000×g，离心20min，分离精浆与精细胞沉淀，精浆备用，精细胞沉淀用PBS（pH=7.4）洗涤后-80℃保存备用。

阴道拭子加少许生理盐水浸渍后在4℃下，以15000×g，离心5min，收集离心后液体备用。

抗凝静脉血离心，在4℃下，以 1 300×g，离心15min，收集上层血清备用。

唾液无需前处理备用。

精浆、阴道液、血清及唾液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度后每管50μL分装，-80℃保存备检。

1.4 精子膜蛋白制备

取部分分离得到的精细胞沉淀物，加入50μL的Western及IP细胞裂解液，同时补加1mmol/L的PMSF及18 mmol/L DTT，移液器吸打混匀，使精细胞膜破坏，4℃下，以12000×g，离心5min。离心后得到的沉淀物加入50 μL的RIPA裂解液（强），并补加1 mmol/L PMSF及18 mmol/L DTT，移液器吸打混匀，冰上裂解30 min，冰浴超声（200 W，破碎3 s，间歇12 s，共5次），使精细胞膜蛋白溶解，4℃下，以15 000×g，离心5min，收集上清液即精子膜蛋白。用BCA法测定蛋白浓度后每管50μL分装，用于免疫印迹实验。

1.5 FUT5蛋白免疫印迹分析

取人精子膜蛋白、精浆、阴道液、唾液及血清，电泳加样的总蛋白质量均为100 μg，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS）浸膜，室温振荡孵育60min。PBST（含0.2%Tween 20的PBS）洗膜，然后加入1∶100稀释的抗FUT5抗体，4℃过夜。洗膜，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000），室温孵育60min。洗膜，然后加入ECL发光液显色，Image Quant凝胶成像分析系统下观察实验结果。

1.6 精细胞FUT5的免疫荧光测定

将15例精细胞沉淀分别重新悬浮在 PBS液（pH=7.4）中，均调至精细胞浓度为1×107/mL。每例样品取2滴精细胞悬浮液（20 μL/滴）分别做成2张涂片（1滴/张），室温自然干燥，100%甲醇室温固定30 min。样本固定后，将15例样本制作的30张涂片分为两组，即经过Triton-100透膜组（加入0.2% Triton-100室温作用20 min）与不经过Triton-100透膜组，然后用含0.2%牛血清白蛋白的PBS室温封闭30min。洗涤载玻片后，加入1:50稀释的抗FUT5抗体，室温孵育60min，洗涤载玻片，加入1:400稀释的Dylight 488荧光标记二抗，室温孵育60min。洗涤载玻片，用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察实验结果。

2 结 果

2.1 FUT5蛋白免疫印迹结果

结果显示在相对分子质量约72000处，人精子膜蛋白裂解液及血清中出现阳性表达带，而在人精浆、阴道液和唾液样本中均未发现特异性的免疫反应沉淀带。提示人精细胞膜和血清中存在与特异性抗FUT5反应的具有较好器官特异性的蛋白，而在精浆、阴道液和唾液中缺乏，可以考虑用于分泌物特异性的鉴定分析。

2.2 FUT5在精细胞的表达与定位

为了确定FUT5在精细胞的表达和定位，精细胞涂片后，应用抗FUT5抗体进行免疫荧光检测，结果显示，经过0.2%Triton-100透膜处理的精细胞头部可见绿色荧光表达的颗粒（图1），而未经过透膜处理的精细胞未见阳性表达。此外，在精细胞的体部和尾部也未检测出特异性反应的荧光。提示精细胞头部表达一定量的FUT5，本研究所用抗FUT5抗体只识别FUT5定位于细胞膜内的氨基酸序列。所得到的数据提示，特异性地定位于精细胞头部的FUT5，可采用识别细胞外部氨基酸序列的FUT5抗体进行特异性结合反应，从而进行精子的确证试验及混合斑中精细胞的分离。

图1 人类FUT5在精细胞中的表达和定位

3讨 论

蛋白质分布显示出的高度特异性对于法医学鉴定具有重要的应用价值。以往研究表明，FUT5在人肝、结肠及睾丸组织有不同程度表达，在T淋巴细胞、急性粒细胞白血病细胞（HL-60）及脑组织有微量的表达[7]，在胃癌细胞也可检测到FUT5的表达[8]。Chiu等[6]发现在精子顶体细胞膜存在FUT5的表达。本研究以精液、阴道液、唾液、血清4种常见的法医学生物检材为研究对象，对FUT5在4种检材中的表达进行了研究，其中的免疫印迹法检测结果提示FUT5在精子膜蛋白及血清中有较高的表达量，而在去除精子后的精浆、阴道液、唾液中未被检测到。人类FUT5位于19号染色体短臂（19p13.3），与FUT3和FUT6串联构成家族性基因簇[9]。FUT5与FUT3和FUT6除了具有相同的酶活性外，其氨基酸存在着高达90%以上的序列同源性。据报道[8-9]，FUT3和FUT6在血清中均有较高的表达，且FUT3、FUT5和FUT6 3种蛋白分子量极其相近，而目前商品化抗FUT5抗体对上述3种蛋白的识别缺乏特异性，因此不能排除血清样本与FUT5抗体是否存在着非特异性反应。进一步的研究需选择特异的抗FUT5抗体和针对FUT5相互作用的配体，以期解决上述难点。然而，阴道液和唾液中未检测到FUT5，提示FUT5的分布具有一定的特异性。

鉴于FUT5与其家族成员FUT3、FUT6具有高度的同源性，并且以羧基端氨基酸的相似度为显著的特性，本实验选用了特异性相对较高的FUT5氨基端抗体，对FUT5在精细胞的表达和定位进行研究。依据精子膜结构的特点，为了准确地鉴定FUT5的细胞表达和定位，对精液样品进行了Triton-100透膜和无Triton-100透膜的处理，对于透膜后的样本，FUT5抗体可透过细胞膜识别位于膜内的氨基端，显示出特异性的荧光颗粒位于精细胞头部，而胞体及精细胞尾部未见特异性荧光。对于未透膜的样本，荧光显微镜下整个精细胞均未见清晰的荧光颗粒。精细胞膜受体蛋白FUT5的表达量可体现出与卵细胞结合的程度，无疑也对受精卵的形成起到一定的作用。本研究对FUT5蛋白免疫印迹检测时电泳加样的总蛋白质量为100μg，并且免疫荧光检测到透膜后精细胞头部荧光强度较弱，提示FUT5可能在精细胞中表达的量不高，推测其表达的程度可能与精子是否获能等影响因素相关。如将FUT5作为一种精斑确证的标记时，应考虑选择灵敏度高的检测方法，例如采用细胞免疫荧光检测技术并增加二抗灵敏度，以保证检出的阳性率。

FUT5的精细胞头部膜定位体现出其生理功能上的特殊意义，该特征也为FUT5作为生物学标记应用于法医学鉴定提供了可能性。本研究的结果显示荧光颗粒分布在精细胞头部的顶体部分，其余部分未见特异的荧光，提示以FUT5作为生物学标记，不仅可以对完整的精细胞进行良好的识别，也可对无精子尾的精细胞进行鉴定。然而，需要指出的是FUT5蛋白羧基端的膜外定位，因其相应的羧基端识别抗体可能与存在于体液或组织细胞中的岩藻糖基转移酶家族的其他成员（主要是FUT3和FUT6）结合，实际检验中将可能干扰抗FUT5抗体与精细胞的特异性反应。而特异性识别FUT5氨基端的抗体又必须在良好透膜试剂的作用下才能完成与细胞内特异序列的结合，否则不具膜穿透性的抗体将很难鉴定精细胞。因此，如果考虑采用抗原（精细胞上的FUT5）与抗体（抗FUT5）特异结合的方法分离精液与阴道液混合斑中精细胞时，则应依据抗体识别的序列慎重选择特异性高的抗FUT5。

更多精细胞膜蛋白的发现与分离以及对其理化特性及生物学功能的深入研究，不仅可为精斑的确证试验开辟新的手段，同时也将为依据抗原-抗体反应方法分离混合斑中精细胞提供新的途径，对法医学检案具有重要的实际应用价值。

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2011-08-06）

（本文编辑：张钦廷）

Distribution Specificity of Human Fucosyltransferase 5 and Its Expression and Localization in Spermatids

LI Feng-rui1,2,ZHOU Yi-shu1,ZHU Lan-hui1,CUI Hong-gang1,WANG Bao-jie1,DING Mei1,PANG Hao1
（1.Department of Forensic Serology,School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001, China;2.Department of Forensic Medicine,Baotou Medical College,Baotou 014060,China）

Objective To investigate distribution specificity of human fucosyltransferase 5（FUT5）as well as its expression and localization in spermatids.Methods Human semen,vaginal swab,saliva and venous blood from healthy individuals were collected.The spermatids were isolated and the spermatid membrane protein was then extracted.Expression levels of FUT5 from human spermatid membrane,seminal plasma, vaginal fluid,saliva and serum were detected by immunoblotting technique.The expression and localization of FUT5 in spermatids were analyzed by immunofluorescent method.Results Immunoblotting technique showed that FUT5 was expressed on spermatid membranes and in serum,but not in seminal plasma,vaginal fluid and saliva.The expressed FUT5 on spermatids was mostly localized on head of spermatids by fluorescent microscopy,suggesting that there was certain amount of FUT5 on human spermatid membrane, and the spermatids might be isolated from mixed stains with vaginal fluid by antigen-antibody reaction. Conclusion Human FUT5 shows a characteristic distribution specificity,and this feature may be used for identification of mixed stain involved in criminal sexual offence in future forensic practice.

forensic genetics;spermatids;specificity;fucosyltransferases

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.009

1004-5619（2012）02-0112-03

高等学校博士学科点专项科研基金项目（20102104 110021）

李冯锐（1981—），女，内蒙古包头人，博士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：rui6826@yahoo.com.cn

庞灏，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事法医物证学研究；E-mail：panghao8@gmail.com