实时RT-PCR常用内对照在死亡早期人心肌内的稳定性

张 萍，马开军，张 恒，王慧君，沈忆文，陈 龙

（1.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032；2.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海 200043；3.复旦大学附属儿科医院 儿童发育与疾病转化医学研究中心，上海 201102）

实时RT-PCR常用内对照在死亡早期人心肌内的稳定性

张 萍1，马开军2，张 恒1，王慧君3，沈忆文1，陈 龙1

（1.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032；2.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海 200043；3.复旦大学附属儿科医院 儿童发育与疾病转化医学研究中心，上海 201102）

目的 探讨实时RT-PCR方法常用内对照表达水平在死亡早期人体心肌组织中的稳定性。 方法选取10例具有一致的外界环境（平均存放温度25℃）、不同死亡时间（4.3～22.3h）的个体，提取心肌组织的总RNA。选择6个常用内对照：β-actin、GAPDH、B2M、U6、18S rRNA、HSA-miR-1，通过实时RT-PCR检测其在心肌组织的表达水平。利用genormPLUS软件评估内对照在死亡早期表达水平的稳定性，挑选出最稳定的内对照并且分析其表达水平与相关因素（年龄、性别、死因）的关系。 结果 死亡早期心肌组织中U6表达水平最稳定，其表达量与年龄、性别及死因无关（P＞0.05）。 结论 U6可以作为实时RT-PCR方法研究死亡时间与心肌组织中核酸降解之间规律的理想内对照。

法医病理学；逆转录聚合酶链反应；心肌；内对照；死亡时间

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断是法医学最重要的任务之一，准确的死亡时间推断，有利于迅速确定涉案罪犯以及排除嫌疑人[1-3]。传统的死亡时间推断方法主要根据尸体现象（如尸斑、尸冷、尸僵、角膜混浊等）[4]、胃内容物的消化程度、蝇蛆的生长规律[5-6]以及植物根系和苔藓类生物的生长变化[7]等，但这些方法都容易受到外界环境的干扰[1，8]。分子生物学技术的飞速发展为这一课题提供了新思路[9]，其中尸体样本中的核酸分析技术的应用，特别是通过实时RT-PCR的方法研究核酸降解规律与死亡时间之间的关系已成为研究的焦点[10-12]。

本实验选择6个常用的内对照，通过实时RT-PCR技术对死亡早期心肌组织中各内对照的转录水平进行检测，分析内对照在死亡早期的稳定性，旨在为利用实时RT-PCR方法进行早期死亡时间推断提供准确稳定的内对照。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RNA later保护液（美国Ambion公司），TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司）。NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo公司），PRISM 7500 Fast实时PCR System（美国AB公司），7500 System软件v2.0.1（美国AB公司），GraphPad Prism v5.0软件（美国Graphpad软件公司），genormPLUS软件（比利时Biogazelle公司）。

1.2 材料

选取10例上海市公安局物证鉴定中心检案案例，尸体的外界环境相似（尸体均在室温下存放和解剖，平均室温25℃）且尸体没有呈现肉眼可见的腐败现象。每例尸体都有较准确的记录，包括死亡时间、死因等（表1）。取适量（50～100 mg）左心室肌肉组织分装于RNA later保护液中，立即置于-80℃冻存。

表1 研究案例的详细信息

1.3 内对照的选择

选择β-肌动蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β2-微球蛋白（beta 2-microglobulin，B2M）、人U6微核RNA（human U6 small nuclear RNA，U6）、18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）和人血清白蛋白-微小RNA-1（human serum albumin-miR-1，HSA-miR-1）共6个内对照。引物设计至少跨一个外显子或外显子区域以保证cDNA正确的合成与扩增，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列见表2。

表2 实验选取的内对照及引物序列

1.4 RNA的提取与cDNA的合成

取冻存组织（约50 mg），按照TRIzol试剂盒总RNA提取说明书操作步骤提取总 RNA，NanoDrop 1000分光光度计测定RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA提取质量。总RNA反转录合成cDNA采用polyA加尾反应[13]。

1.5 实时RT-PCR

应用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时RT-PCR反应。按说明书配制20μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL、cDNA模板1μL、双蒸灭菌水7.8 μL。应用PRISM 7500 Fast实时PCR System进行两步法扩增，条件如下：95℃30s预变性；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。经7500 System软件v2.0.1分析可得到样本各内对照的循环阈值（cycle threshold，Ct值）。

1.6 统计学分析

采用genormPLUS软件将某一内对照与其他内对照表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M。按照操作说明对6个内对照的Ct值进行统计学处理。采用GraphPad Prism v5.0软件进行相关性统计分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 内对照稳定性评估结果

在本研究中所采用的内对照的M值见表3。因为M值越小，内对照表达水平越稳定，由表3可知，各内对照的表达稳定性由高到低排序依次为：U6＞18S rRNA＞HSA-miR-1＞B2M＞GAPDH＞β-actin，因此U6是表达最稳定的内对照。

表3 内对照稳定性评估结果

2.2 U6表达水平与性别、年龄、死因之间的关系

分别采用t检验、Pearson相关分析和Kruskal-Wallis检验，分析U6与性别、年龄及死因之间的关系。结果表明，在死亡早期U6的表达水平是稳定的，U6在心肌组织中的表达量不受性别的影响，男性与女性表达差异无统计学意义（P＞0.05）；U6的表达量与年龄之间无相关性（r=-0.3516，P＞0.05），排除了年龄因素对U6表达的影响；在失血性休克、心源性猝死与其他死因之间，U6的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。综合分析，在死亡早期U6的含量不受性别、年龄与死因的影响。

3 讨 论

死亡时间的推断一直是法医学领域最重要且复杂的课题，其推断方法多种多样，但准确性却不尽相同。近年来国内外学者应用实时RT-PCR技术测定机体死后生物样本中某种特异性RNA含量来推断死亡时间已成为研究热点[10-12]。实时RT-PCR方法在检测基因表达水平方面与其他检测方法相比具有很好的灵敏性与特异性[14]，与RT-PCR技术相比，具有方便、稳定的优点，不仅可对扩增后电泳条带进行分析，也可对扩增的全过程加以监测，利用循环阈值（Ct值）与起始模板浓度的对数呈反比关系来计算mRNA的表达水平。但其结果依赖于准确的内对照标准化[15]。因此，对于死后的组织，找出合适的内对照对于基因表达分析的准确定量至关重要。

Vandesompele等[16]于2002年编写了geNorm程序，用于候选内对照的稳定性排序及找出合适的内对照。genormPLUS是对geNorm的改良，作为内对照选择的良好工具，其核心原理在于：不同实验对象中，2个理想内对照表达水平的比值在所有样本中应一致，表达水平比值变异度的增加意味着待测单一或2个内对照表达稳定性的下降。该程序将某一内对照与其他内对照表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定性的平均值M，并对所有候选内对照的表达稳定性进行排序[16]。本研究选用β-actin、GAPDH、B2M、U6、18S rRNA和HSA-miR-1 6个不同功能的常用内对照作为早期死亡时间研究的候选内对照。GAPDH、B2M是常用的作为内对照的管家基因[17]，而18S rRNA和U6常被用作miRNA研究的内对照[18]。目前的研究还发现HSA-miR-1与心脏的发育分化及功能相关[19]。经genormPLUS统计处理后可知，U6表达最稳定，可以作为利用实时RT-PCR方法研究早期死亡时间推断的内对照。本研究结果与理论期望也是相符的，U6作为核内小RNA更不容易受外界环境的影响，在死亡早期相对表达更稳定。

为了排除性别、年龄及死因等对候选内对照表达量的影响，本实验还做了进一步的研究，以确定U6可以作为一个稳定的内对照应用于死亡时间推断研究。结果表明，U6的表达与性别、年龄及常见的死因（失血性休克、心源性猝死、颅脑损伤、机械性窒息）无明显的相关性（P＞0.05）。

综合分析，笔者认为利用心肌组织中的U6作为内对照进行早期死亡时间推断的研究，可以使实时RT-PCR的结果更加准确、可靠。稳定的内对照选取，可以排除个体差异带来的误差，使统计结果更加客观、准确，从而发现具有实际意义的现象及规律，以便对利用实时RT-PCR这一方法研究核酸时间依赖性降解规律提供更可靠的依据。进一步的工作将在其他常用检材组织，比如皮肤、骨骼肌、脑、脾等进行研究，寻找每个器官、组织最适合的内对照，以期运用其建立多指标降解规律与死亡时间之间的数学模型。

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2011-11-03）

（本文编辑：刘宁国）

Evaluation on Stability of Internal Controls in Human Cardiac Muscle by Real-Time RT-PCR during Early Postmortem Interval

ZHANG Ping1,MA Kai-jun2,ZHANG Heng1,WANG Hui-jun3,SHEN Yi-wen1,CHEN Long1
（1.Department of Forensic Medicine,Shanghai Medical College,Fudan University,Shanghai 200032,China;2.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Institute of Forensic Medicine,Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 200043,China;3.Research Center for Children Development and Translational Medicine,Children’s Hospital,Fudan University,Shanghai 201102,China）

Objective To explore the stability of internal controls in human cardiac muscle by real-time RT-PCR during early postmortem interval（PMI）in order to find the most stable marker.Methods Ten individuals with similar environmental conditions（the average store temperature：25℃）and different PMI ranging from 4.3 to 22.3 h were selected.Total RNA was extracted from each sample and six commonly internal controls were used including β-actin,GAPDH,B2M,U6,18S rRNA and HSA-miR-1,and the expression was detected in cardiac muscle by real-time RT-PCR.The expression stability of internal controls was evaluated using genormPLUSsoftware during early PMI.The internal control with the most stability was selected.The relationship between the most stable marker and its expression level affected by some other parameters such as age,gender and cause of death was also analyzed.Results The U6 showed the most stable expression during early PMI in cardiac muscle,and its expression level was not affected by those parameters including age,gender and cause of death（P＞0.05）.Conclusion U6 may be a valuable internal control for the study of relationship between PMI determination and degradation of nucleic acid in human cardiac muscle by real-time RT-PCR.

forensic pathology;reverse transcriptase polymerase chain reaction;myocardium;internal control;postmortem interval

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.001

1004-5619（2012）02-0081-04

国家自然科学基金资助项目（81172896）

张萍（1985—），女，山东德州人，硕士研究生，主要从事法医学研究；E-mail：09211010058@fudan.edu.cn

陈龙，男，副教授，主任法医师，主要从事法医病理学及法医临床学研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn