增强化学发光法检测基质金属蛋白酶-11鉴定月经血

章雅清，陆惠玲，姚亚楠

（1.海南省血液中心法医物证司法鉴定所，海南 海口 570311；2.中山大学中山医学院法医物证教研室，广东 广州 510080；3.中山大学附属第一医院，广东 广州 510080）

增强化学发光法检测基质金属蛋白酶-11鉴定月经血

章雅清1，2，陆惠玲2，姚亚楠3

（1.海南省血液中心法医物证司法鉴定所，海南 海口 570311；2.中山大学中山医学院法医物证教研室，广东 广州 510080；3.中山大学附属第一医院，广东 广州 510080）

目的 探讨增强化学发光法检测人基质金属蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11）鉴定月经血的法医学应用价值。 方法 运用增强化学发光法检测月经血痕、阴道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中的MMP-11，考察MMP-11的组织特异性、稳定性及检测方法的灵敏度。 结果 月经血痕中MMP-11蛋白的检测阳性率为89.47%，阴道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中均未检出MMP-11。当上样量为25μL时，蛋白质量浓度为1.329μg/μL，可检出MMP-11。4℃放置20个月的MMP-11阳性的月经血痕，检测阳性率为89.58%。 结论 用增强化学发光法检测MMP-11蛋白的方法灵敏度高、特异性好，能用于月经血与外周血、阴道液等常见斑痕的鉴别。

法医遗传学；化学发光测定法；基质金属蛋白酶-11；月经血

在法医学血痕检验中，有时出血部位的确认，尤其是月经血的确认显得非常重要。目前研究表明，人基质金属蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11）可作为鉴定月经血的标志物[1-3]。本研究采用本课题组前期制备的兔抗人MMP-11多克隆抗体[4-5]，运用免疫印迹法转膜、增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，检测MMP-11，以期为鉴定月经血提供科学、可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样本

选择健康、月经周期正常的志愿者33名，分别收集经期第1～4天内的月经血痕，其中2名志愿者提供3个经期（第1～4天）的月经血痕，共114份。收集健康女性的阴道拭子、外周血痕、唾液斑及尿液斑各30例；健康男性精液17例，移至干净纱布晾干。以上标本于4℃保存。

1.1.2 主要试剂

MMP-11蛋白阳性对照液，由本课题组前期制备[4]；兔抗人MMP-11多克隆抗体，由本课题组前期制备[4-6]；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL发光液购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 各种斑痕中MMP-11的检测

分别剪取4℃保存1个月内的月经血痕、阴道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑、精液斑约10mm×10mm，置微量离心管中，加入预冷的裂解液（50mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，150mmol/L NaCl，1%NP-40，0.5%SDC，0.1%SDS，1 μg/mL抑肽酶，0.02%叠氮钠）100 μL，加入100 mmol/L PMSF 1 μL，于4℃浸泡1 h。4℃下以5000×g，离心10min，取上清液进行蛋白定量。取60μg的总蛋白样本经12%SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜上；用含5%脱脂奶粉的封闭液室温下封闭2h，将膜浸入1∶1000稀释的自制兔抗人MMP-11多克隆抗体内，置湿盒4℃孵育过夜；将膜浸入1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体内，室温孵育1.5 h；在膜上滴加发光液，1～2 min后将X线胶片覆盖在膜上曝光1～5 min，显影液冲洗3～5 min，定影液中漂洗，直至胶片出现清晰的条带。

1.2.2 灵敏度及稳定性检测

剪取MMP-11检测阳性的月经血痕约20 mm× 20 mm，加入预冷的裂解液200 μL和100 mmol/L的PMSF 2 μL，于4℃浸泡1 h，4℃下以5 000×g，离心10min。取上清液，进行蛋白定量，制成含不同蛋白量的样本系列进行灵敏度检测。取本课题组前期收集的于4℃放置20个月的MMP-11阳性的月经血痕48份进行稳定性检测。

2 结 果

2.1 各种斑痕MMP-11的检测结果

114份月经血中有102份MMP-11蛋白检测阳性，阳性率为89.47%（表1）。33名志愿者除1名志愿者4 d的月经血痕均阴性外，其余32名均能检测到MMP-11；2名提供3个经期月经血的志愿者，其3个经期的月经血痕MMP-11检测结果均为阳性。阴道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中均未检出MMP-11（图1）。

表1 33名志愿者1～4d月经血MMP-11检测结果（份）

图1 各种斑痕MMP-11的检测结果

2.2 灵敏度及稳定性检测结果

2.2.1 灵敏度检测

方法灵敏度结果见图2，当上样量为25 μL时，蛋白质量浓度为1.329μg/μL，即可检测出MMP-11。

图2 月经血痕MMP-11的灵敏度检测结果

2.2.2 稳定性检测

48份4℃保存20个月的MMP-11阳性的月经血痕有43份检测出MMP-11，阳性率为89.58%。

3 讨 论

MMP-11是人基质金属蛋白酶家族中的成员，在月经周期中表达量明显高于其他MMP的含量，尤其在子宫内膜脱落形成月经血的阶段最为明显，这种特征性的变化提示MMP-11可作为鉴定月经血的标志物[1-3]。国外学者采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测MMP-11 mRNA的方法来鉴别月经血和其他损伤出血[7-8]。但RNA的稳定性较差，RT-PCR方法技术要求又高，操作过程相对繁琐、耗时，易出现假阴性结果，检测的成本也较高。这些不利因素严重阻碍了MMP-11 mRNA在法医学实际工作中的应用。

免疫印迹法（immunoblotting）又称蛋白印迹法（Western blotting）是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种免疫化学方法。其借助SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白抗原分离，然后转印到膜上，再用特异性抗体确定抗原。根据标记二抗的标记物不同，其杂交的结果检测方法也不同，较常用的检测系统有辣根过氧化物酶标记二抗的增强化学发光法和3′，3′二氨基联苯胺（DAB）检测系统。

DAB可以和辣根过氧化物酶作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高、特异性好，但膜显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，而且试剂有毒。增强化学发光法是在辣根过氧化物酶催化化学发光物质的反应中添加了一些增强剂，以加强反应的发光强度。随着灵敏度更高的发光底物的研制，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别。增强化学发光法的优点是：（1）显色后的胶片能长期保存；（2）特异性好，通过调整曝光时间可以控制非特异条带的出现。本试验采用1～5min的曝光时间，显带图谱清晰，月经血痕只有一条特异带，其他斑痕未见任何条带，完全消除了非特异条带。

本实验采用增强化学发光法对114份月经血痕进行检测，MMP-11检出的阳性率为89.47%。姚亚楠等[5]用DAB显色检测105份月经血痕，阳性率为88.57%（93/105）。Bauer[8]检测66份月经血痕MMP-11 mRNA的阳性率为84.8%。本方法的阳性率与其他两种方法基本一致。

Ferri等[9]对1例室温放置1年以上的月经血痕进行MMP-11 mRNA的特异检测，结果仍为阳性。姚亚楠等[5]对在4℃保存12个月的MMP-11阳性的月经血痕再次检测MMP-11，成功率为91.67%（11/12）；对在室温下放置12周的阳性月经血痕检测MMP-11，成功率为75.0%（9/12）。本实验对在4℃保存20个月的48份阳性月经血痕检测MMP-11，阳性率为89.58%。这说明MMP-11抗原稳定性较好，在4℃条件下能保存较长时间。

姚亚楠等[5]采用免疫印迹DAB显色方法检测MMP-11，灵敏度为月经血蛋白量≥39.76μg（相当于月经血1.5μL）。本研究采用免疫印迹增强化学发光法检测MMP-11，当上样量为25μL时，蛋白质量浓度为1.329μg/μL，可检出MMP-11，略高于DAB显色法。

免疫酶组织化学技术是病理学较为常用的一种研究方法，能进行特定组织和细胞中阳性信号的定位，直接观察抗原在细胞和间质中的存在，证实和解决许多常规染色难以判定的问题[6]。姚亚楠等[6]采用链霉卵白素-碱性磷酸酶（SAP）免疫组化法，对MMP-11的组织特异性进行研究。结果显示，MMP-11有选择性地富集于子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞内。但免疫组化需要目的蛋白有一定量的表达才可以检测到，而且结果比较主观，染色深浅受很多因素影响，有时会有假阳性，不易与背景区分；且灵敏度相对较低，试验所需抗体量较多。Western blotting方法则可以借助凝胶电泳将检品中的杂蛋白进行分离，加上分子量对照和内参照，可以准确地判断目的蛋白，结果更客观，并且可用于微量蛋白表达的研究和半定量分析。从质量控制的角度讲，Western blotting优于免疫组化方法。姚亚楠等[6]用免疫组化法检测放置1个月的月经血痕，虽能检见MMP-11阳性染色颗粒，但特异信号微弱。本实验对放置20个月的血痕采用免疫印迹增强化学发光法检测，在胶片上依然可以看到清晰的MMP-11特异性条带。本研究的结果证实Western blotting法较灵敏可靠，可用于月经血痕的检测，更适用于法医学鉴定实践。

目前胶体金标记的试剂条已广泛应用于法医物证检测中，如果能按照金标试剂条的制作原理，制作检测MMP-11蛋白的试剂条，将使鉴定月经血的方法更简便、快捷。

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[2]Goffin F，Munaut C，Frankenne F，et al.Expression pattern of metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix-metalloproteinases in cycling human endometrium[J].Biol Reprod，2003，69（3）：976-984.

[3]郑晶，陆惠玲，陈森.月经血鉴定与基质金属蛋白酶-11[J].法医学杂志，2006，22（1）：S1-S3.

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[9]Ferri G，Bini C，Ceccardi S，et al.Successful identification of two years old menstrual bloodstain by using MMP-11 shorter amplicons[J].J Forensic Sci，2004，49（6）：1387.

2011-12-14）

（本文编辑：李成涛）

Detection of Matrix Metalloproteinase-11 in Menstrual Blood by Enhanced Chemiluminescence Method

ZHANG Ya-qing1,2,LU Hui-ling2,YAO Ya-nan3
（1.Forensic Judical Appraisal Institute,Blood Center of Hainan Province,Haikou 570311,China;2.Department of Forensic Biology,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China; 3.The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China）

Objective To explore the forensic application value of detection of matrix metalloproteinase-11（MMP-11）in menstrual blood by enhanced chemiluminescence method.Methods Menstrual blood,vaginal swab,peripheral blood,saliva stain,urine stain and semen stain were collected to detect whether or not there were MMP-11 using enhanced chemiluminescence method.The specificity and reliability of the MMP-11 assay along with its sensitivity were evaluated.Results The positive detection rate of MMP-11 in menstrual blood was 89.47%,whereas no MMP-11 was found in vaginal swab,peripheral blood,saliva stain,urine stain and semen stain.When 25 μL sample was added,the mass concentration of protein was 1.329μg/μL,then MMP-11 could be detected.A positive detection rate of 89.58%was observed in MMP-11 positive menstrual blood samples after stored at 4℃ for 20 months.Conclusion Enhanced chemiluminescence method is sensitive and specific for detecting MMP-11,and can be applied to distinguish menstrual blood from common stain such as peripheral blood,vaginal fluid.

forensic genetics;luminescent measurements;matrix metalloproteinase-11;menstrual blood

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.008

1004-5619（2012）02-0109-03

国家自然科学基金资助项目（30471933）

章雅清（1979—）女，山西人，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：fywzzyq2005@yahoo.com.cn

陆惠玲，女，教授，主要从事法医物证学研究；E-mail：luhl@mail.sysu.edu.cn