NOS2A基因启动子区基因多态性与缺血性脑卒中关系的研究

阚春燕， 高 鹏， 袁 冬， 杜丹华， 吴 江

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是致残率和致死率最高的常见疾病之一［1］。而动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)斑块破裂和血栓形成是导致急性心脑血管事件的主要原因。

近年来，研究者认识到动脉粥样硬化是由多种炎性细胞因子参与的血管慢性炎症反应过程，炎症反应和AS的发生发展密切相关［2］。由iNOS催化产生的NO是机体慢性炎症反应的重要参与因子之一［3］，可引起血管内皮损伤、促进血管壁的炎症反应，还可氧化LDL形成ox-LDL，促进动脉粥样硬化的发生发展，导致粥样斑块的不稳定［4］。因此，我们对编码iNOS的NOS2A基因多态性进行检测，探讨其与缺血性脑卒中的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取吉林大学第一医院神经内科2009年～2010年的住院患者324例作为病例组，其中男234 例，女90 例，平均年龄(57.1 ±10.1)岁，经神经科检查、头部CT或头部MRI明确脑卒中诊断，并除外房颤、肿瘤等栓子来源的脑栓塞性疾病，除外肝肾功能不全及血液系统疾病。由患者本人或其家属提供患者的临床症状及既往病史。对照组来自吉林大学第一医院体检中心的健康体检者，共455例，其中男319例，女136例，平均年龄(50.7±8.8)岁。入组对象签署知情同意书，并采集全血用于DNA提取。

1.2 选择 NOS2A启动子区-969G/C，-1173C/T的两个位点为遗传标记，通过对NOS2A启动子区进行全长测序以分析这两个位点的基因型。

1.3 实验方法 (1)标本采集:抽取患者、对照者空腹外周静脉血置于-20℃冰箱保存备用。(2)基因组DNA的提取:采用Wizard基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)抽提基因组DNA。(3)基因组DNA浓度与纯度测定:用ND-1000紫外/可见光分光光度计(NanoDrop，美国)进行定量测定，调整模板DNA浓度在25～50ng/μl。(4)聚合酶链反应(PCR):基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’-AAAACCCTCTCAAAACAGC-3’;下游引物:5’-TTGGTAGAGACTGGGTTTCA-3’。 反 应 体 系(20μl):DNA 模板 2μl、10 × buffer 2μl、dNTP 1μl、PCR 引物2μl(上游引物、下游引物各 1μl、TaqDNA聚合酶 0.15μl、ddH2O 12.85μl)。PCR 反应条件:预变性 95℃5min，变性 94℃30s，退火 66℃40s，延伸72℃1min30s，共进行 38个循环，最后延伸 72℃10min。(5)PCR产物的检测:取PCR扩增产物2μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，JS-380A凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)下观察结果。(6)PCR产物回收纯化:PCR产物转移到AcroPrep 384滤板上进行浓缩纯化。(7)PCR产物测序:将已纯化的基因组DNA样本经热循环处理后于ABI 3730 DNA Analyzer(ABI，美国)进行扫描测序。

1.4 统计学分析 应用拟和优度检验分析病例组和对照组基因型频率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H.W)平衡;UNPHASED遗传学软件应用cocaphase对等位基因频率进行分析，SPSS 15.0软件应用卡方检验对基因型频率进行分析。

2 结果

2.1 -969G/C、-1173C/T不是中国北方汉族人的SNP位点 通过对NOS2A基因启动子区的测序，发现-969G/C、-1173C/T不是中国北方汉族人的SNP位点，NOS2A-969C位点的等位基因均为 T，NOS2A-1173C位点的等位基因均为G。

2.2 脑卒中组与对照组rs2779248位点Hardy-Weinberg平衡检验 我们在NOS2A基因启动子区检测到了rs2779248位点，并对该位点在脑卒中组与对照组的等位基因及基因型频率进行了比较。拟和优度检验表明病例组(χ2=0.015，P=0.903)和对照组(χ2=3.141，P=0.076)rs2779248 的基因型分布均未偏离H-W平衡。

2.3 脑卒中组与对照组rs2779248位点等位基因频率比较 脑卒中组与对照组rs2779248位点等位基因频率比较无明显差异(P=0.889，χ2=0.019，见表1)。

2.4 脑卒中组与对照组rs2779248位点基因型频率比较 脑卒中组与对照组rs2779248位点基因型频率比较无明显差异(P=0.889，χ2=0.019，见表2)。

表1 脑卒中组与对照组rs2779248位点等位基因频率比较

表2 脑卒中组与对照组rs2779248位点基因型频率比较

3 讨论

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体内一种重要的信号分子，它是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化 L-精氨酸(L-arginin)转化而成［5］，而NOS又分为诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶以及神经元型一氧化氮合酶3个亚型［6］。在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞中iNOS表达及活性增加，可诱导产生大量的NO自由基，引起过氧化亚硝酸盐形成增多、活性增加，导致脂质过氧化和血管损伤，进而引起血管内皮功能障碍、炎性介质释放，加重血管炎症反应，从而促进动脉粥样硬化的发展。而动脉粥样硬化又是脑卒中发病的重要病理生理基础，因此我们将编码iNOS的NOS2A基因作为候选基因。

NOS2A 基因定位于17q11.2-q12，全长37kb，包含26个外显子和25个内含子。已有研究表明iNOS基因多态性与溃疡性结肠炎、克罗恩病、风湿性关节炎、前列腺癌、胃癌等多种炎症及免疫调节反应相关疾病有关［7］。针对NOS2A基因进行的基因治疗可明显减小心肌梗死的体积［8］。杜丹华等对NOS2A基因多态性与脑卒中合并冠心病的关系进行了检测，发现rs28944190位点C等位基因与脑卒中合并冠心病的发生存在相关性［9］。Hobbs等在坦桑尼亚和肯尼亚进行的研究证实NOS2A基因启动子区-969G/C、-1173C/T变异可减轻疟疾感染后症状的严重程度［10，11］。NOS2A 启动子区变异与原发性高血压有关［5］。此外NOS2A基因是炎症反应通路中的一个关键基因。因此我们选择NOS2A基因为候选基因，以-969G/C、-1173C/T位点为候选位点，采用启动子区全长测序的方法探讨NOS2A基因启动子区基因多态性与缺血性脑卒中的关系。我们发现NOS2A-969G/C、-1173C/T位点在中国北方汉族人中不存在变异，说明SNPs在不同种族间存在差异。我们在NOS2A启动子区检测到了rs2779248位点，关联分析表明rs2779248位点与缺血性脑卒中无相关性。提示NOS2A基因启动子区与缺血性脑卒中的发病无明显相关。

虽然本研究未发现NOS2A基因启动子区的常见变异与缺血性脑卒中的相关性，但在中国北方汉族人群NOS2A基因与高血压、缺血性脑卒中严重程度等的关系还需要进一步的探讨。

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