山核桃饼粕分离蛋白的提取工艺研究

杨 瑾，董 明，曹彬彬，赵晓佳

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

山核桃饼粕分离蛋白的提取工艺研究

杨 瑾，董 明*，曹彬彬，赵晓佳

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

以山核桃饼粕为原料，利用碱溶酸沉的提取工艺，以碱提pH、料液比和碱提温度为实验因素，山核桃蛋白浸出率为目标建立回归数学模型，采用二次正交旋转组合设计实验方法得到山核桃蛋白的最优提取条件。实验结果表明：山核桃蛋白的最佳提取工艺为pH9.0、料液比1∶25、碱提温度为57℃，在此条件下山核桃蛋白提取率可达到56.88%。关键词：山核桃蛋白，二次正交旋转组合设计，提取工艺

山核桃（Caryc.cathyensis Sarg），又名“小胡桃”、山核桃楸，是世界性的木本油料树种和名优干果[1-3]。在我国栽培面积较大，主产于天目山区，安徽的宁国、绩溪、歙县和浙江的临安、淳安等县市区均有自然分布。安徽大别山区也有天然次生山核桃林分布，果核壳薄、出仁率和出油率均较高，是优良的果用林[4-7]。山核桃坚果千粒重3040～4425g，出仁率43.7%～49.2%；干仁蛋白质含量7.8%～9.6%，含油率69.8%～74.1%，其中不饱和脂肪酸占88.38%～95.78%[8]，氨基酸含量高达25%。山核桃果肉中还含有22种矿物质元素，特别是钙为133mg/100g，锌为12.59mg/100g，含量均大大高于一般干果仁。目前，仅浙江省山核桃年产量就在1万t以上，而对于山核桃的利用除了直接食用外，大部分都用于油料榨取上，而剩余压榨后的山核桃饼粕基本被弃去没有被再次加工，这就使原料未能得到充分利用，很多营养成分也随之流失，造成大量不必要的浪费[9]。目前，以山核桃饼粕为原料提取蛋白的报道较少，对于山核桃饼粕的综合开发没有得到足够的重视。为了使原料得以充分利用，最大化山核桃的价值，本文以山核桃饼粕为原料，采用碱溶酸沉法提取山核桃蛋白，并结合二次正交旋转组合设计实验方法，建立了以蛋白质浸出率为目标函数的数学模型，重点研究了碱提pH、料液比和碱提温度之间的关系，为山核桃蛋白的提取工艺提供了理论依据，为山核桃饼粕的资源综合利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山核桃饼粕 经压榨油后得到，含山核桃碎壳，安徽省詹氏山核桃食品有限公司提供；氢氧化钠、柠檬酸、亚硫酸钠 均为分析纯。

DFT-100多功能中药粉碎机 温岭市大德中药机械有限公司；FA2104万分之一电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ-500DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DL-5-B飞鸽牌系列离心机 上海安亭科学仪器厂；PHB-4雷磁牌数字型pH计 上海精科雷磁公司；78-1磁力加热搅拌器 金坛市金城国胜实验仪器厂；Y5-1500环保型全钢通风柜 天长市恒洋工贸有限公司；调节式万用电炉 通州市申通电热器厂；Scientz-12SN冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；KDN-04C消化炉 上海洪纪仪器设备有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 材料带回实验室后，经中药粉碎机粉碎后，过80目筛，密封备用。1.2.2 工艺流程[10]压榨油后的山核桃饼粕→粉碎→浸泡→调pH碱性→超声波浸提→静置30min→4000r/min离心20min→去下层沉淀→滤液调pH酸性并搅拌→4000r/min离心20min→取沉淀层→冷冻干燥

1.2.3 山核桃蛋白提取率[11]在本实验中蛋白质提取率以浸出率为指标。蛋白质浸出率按照下式计算：

式中：Y-浸出率，%；m1-山核桃原料蛋白的质量，g；m2-冷冻干燥后蛋白的质量，g。

1.2.4 提取工艺的单因素和二次通用旋转组合实验 主要以浸提方式和时间、料液比、碱提pH、碱提温度和酸沉pH对山核桃蛋白提取率的影响，以浸出率为检测指标，进行单因素实验，每个实验平行三次，取平均值。在单因素实验的基础上，设计3因素3水平的二次正交旋转组合实验，以山核桃蛋白浸出率为考核指标，确定最优提取方案和工艺参数。实验设计见表1。

表1 二次正交旋转组合设计因素水平表Table 1 Factors and code levels of quadratic orthogonal rotation combination design

1.3 统计分析

二次正交旋转组合设计的实验结果分析均在DPS数据处理软件上运行。

式中：Dx、Dy分别为泥沙扩散系数沿x、y方向的取值；s为含沙量；Fs为底部冲刷函数，采用切应力理论表达式如下：

2 结果与分析

2.1 浸提方式和时间对山核桃蛋白提取率的影响[12]

在料液比1∶20、温度55℃、pH8.5，用超声波，磁力搅拌器和水浴的方法分别对山核桃粉浸提0.5、1、1.5、2h，以蛋白质浸出率为指标，确定方法和时间对提取山核桃蛋白浸出率的影响如图1。

图1 不同浸提方式和时间对山核桃蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different time and method

由图1可知，利用超声波提取山核桃蛋白较常规的方法提取率高，并且提取出来的山核桃蛋白颜色较浅，所以在以后的实验中继续采用超声波方法提取。用超声波方法浸提1、1.5、2h，所得蛋白浸出率为49%～52%之间，差异不明显，为了节约时间和能源，在以后实验中选取山核桃渣超声波浸提1h为佳。

2.2 料液比对山核桃蛋白提取率的影响

在温度55℃，pH8.5，分别按料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的条件下对山核桃粉超声波浸提1h，以蛋白质浸出率为指标，确定料液比对提取山核桃蛋白浸出率的影响如图2。

图2 料液比对山核桃蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different solid-liquid ratio

由图2可知，随着料液比的增加，蛋白质的浸出率也在增大，在料液比大于1∶20后，蛋白质溶出率增加缓慢。在实验范围内料液比为1∶30时，蛋白质溶出率最好，为49.7%，但在料液比为1∶25时，蛋白质溶出率亦达到47%。在料液比较小时，提取率不是很高，这是因为山核桃蛋白在溶液中具有一定的溶解度，在蛋白质溶解达到饱和时，过量的蛋白质不再溶解，料液比提高而提取率也不再提高。

2.3 碱提pH对山核桃蛋白提取率的影响

在料液比1∶20，温度55℃，分别在pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的条件下用超声波方法浸提1h，以蛋白质浸出率为指标，确定碱提pH对提取山核桃蛋白浸出率的影响如图3。

图3 不同pH对山核桃蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different pH

由图3可知，pH对蛋白质的提取率有明显的影响，随着pH的增大，提取率逐渐升高，pH＜8.5时增速比较明显。在实验中发现，pH的变化会影响所提取山核桃蛋白成品的颜色，而且随着pH的增大，颜色也越来越深。在pH为9.0以上时，形成了一些酚醛类物质，使成品颜色呈现黑褐色，但在pH7.0～9.0范围内，颜色较浅，因此选用8、8.5、9.0为碱提pH的三个水平。

2.4 碱提温度对山核桃蛋白提取率的影响

图4 不同温度对山核桃蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different temperature

由图4可知，随着温度的增加，山核桃蛋白质的提取率逐渐增加，超过55℃时，浸出率呈下降趋势。这主要是由于温度升高，引起蛋白质变性的原因造成的。温度为55℃提取率最高，50℃和60℃次之。故选取50、55、60℃为温度的3个水平。

2.5 酸沉pH对山核桃蛋白提取率的影响

在料液比1∶20，温度55℃，pH8.5条件下用超声波方法浸提1h，然后用酸调节山核桃蛋白溶液至不同pH：3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4进行酸沉淀，以蛋白质浸出率为指标，确定酸沉pH对提取山核桃蛋白率的影响。

图5 山核桃蛋白酸沉pH的确定Fig.5 The optimum pH for pecan meal protein precipitation

由图5可知，在pH为4.4～4.8，山核桃蛋白沉淀迅速，提取率的波动范围不大，其中，pH为4.6时，山核桃蛋白的提取率最高。由此可以判断，山核桃蛋白等电点为4.6左右。

2.6 二次正交旋转组合实验

根据单因素实验结果，以对山核桃蛋白影响较大的pH（X1）、料液比（X2）、碱提温度（X3）为3个实验因素，以山核桃蛋白浸出率为目标，设计3因素3水平的二次正交旋转组合实验设计，用以优化山核桃蛋白的提取条件，确定pH（X1）、料液比（X2）、碱提温度（X3）的零水平分别为8.5、1∶25、55℃，实验设计及结果如表1和表2。

由pH、料液比、碱提温度等3个因素对山核桃蛋白浸出率相互作用所得结果见表3。同时，根据多项式回归方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii2，按实验结果计算出拟合方程的各项系数，从而得到回归方程：Y= 52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.36754X12-0.93853X22-1.82772X32-0.38875X1X2-0.11375X1X3-0.36625X2X3

表2 二次正交旋转组合设计实验方案及结果Table 2 The test scheme and results of quadratic orthogonalrotation combination design

表3 实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of test results

由表3可知，回归方程的失拟性检验F1=0.88239＜F0.01（5，8）=3.69不显著，可认为所选用的二次回归模型是适当的；回归显著性检验F2=17.79885＞F0.01（9，13）= 4.17极显著，说明模型的预测值与实际值非常吻合，模型成立。对回归系数显著性检验，在α=0.10显著水平剔除不显著项后，得到优化后的回归方程为：

Y=52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.93853X22-1.82772X32。

2.6.1 单因素分析 根据实验结果对单因素进行效应分析，结果见表4及图6。

由表4和图6可以看出，pH对山核桃蛋白浸出率影响最大，其次是碱提温度，料液比对山核桃蛋白浸出率影响最小。随着pH的增加，山核桃蛋白浸出率也随之增加，接近线性关系，表明这个因素作用显著，与单因素实验基本吻合。但在实验中发现，pH的变化会影响所提取山核桃蛋白成品的颜色，而且随着pH的增大，颜色也越来越深。在实验水平1.0000，此时pH为9.0时，会形成一些酚醛类物质，使成品颜色呈现黑褐色。因此选择最优方案时要在浸出率和颜色两个方面综合考虑。

表4 单因素效应分析Table 4 Effective analysis of single factor

图6 各单因素与山核桃蛋白提取率的关系Fig.6 The relationship of single factors with the protein extracting rate from pecan meal

随着碱提温度的增加，山核桃蛋白浸出率也逐渐增大，当碱提温度的实验水平为0.5000时，即温度达到57.5℃时，山核桃蛋白的浸出率达到最高。而后温度再升高时，山核桃蛋白浸出率则逐渐降低，主要原因是山核桃蛋白对热比较敏感，受热易变性。

料液比对山核桃蛋白浸出率的影响在实验水平0.5000时达到最高，此时料液比为1∶27.5。山核桃蛋白的提取过程，其实就是山核桃蛋白的溶出过程，理论上说，料液比越大，则液相主体的溶质浓度低，传质推动动力越大，浸取速度增加，但是料液比增大，溶剂的用量加大，溶液趋于饱和，同时溶出的其它杂质的机会也越多，因此要选择合适的料液比。

图7 pH（X1）与料液比（X2）的交互作用图Fig.7 The interplay of pH（X1）and solid-liquid ratio（X2）

2.6.2 交互作用效应分析 选取一个因素固定于零水平，考察另两个因素的交互作用，分别作图可以直观地分析各因子间的互作效应，结果分别见图7～图9。

图7为pH（X1）与料液比（X2）的交互作用图，由图可知，在一定料液比（X2）下，随着pH（X1）的升高，山核桃蛋白的浸出率呈现逐渐升高且增速趋缓的走势，表明pH对山核桃蛋白的浸出率作用显著。而在一定的pH（X1）下，料液比（X2）的增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到达最高之后，山核桃蛋白的浸出率会随着料液比（X2）的升高而降低，变化趋于平缓，这是因为蛋白质溶解达到饱和时，过量的蛋白质不再溶解，提取率不再提高。当pH（X1）和料液比（X2）均处于较高水平时，山核桃蛋白的浸出率都比较高。

图8 pH（X1）与碱提温度（X3）的交互作用图Fig.8 The interplay of pH（X1）and temperature（X3）

图8为pH（X1）与碱提温度（X3）的交互作用图，由图可知，在一定碱提温度（X3）下，随着pH（X1）的升高，山核桃蛋白的浸出率逐渐升高。而在一定的pH（X1）下，碱提温度（X3）的增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到达最高之后，山核桃蛋白的浸出率会随着碱提温度（X2）的升高而降低，说明碱提温度（X3）对山核桃蛋白的浸出率有很大影响。当pH（X1）水平最低，碱提温度（X3）的水平也最低时，山核桃蛋白的浸出率达到最低。

图9 料液比（X2）与碱提温度（X3）的交互作用图Fig.9 The interplay of solid-liquid ratio（X2）and temperature（X3）

图9为料液比（X2）与碱提温度（X3）的交互作用图，由图可知，在碱提温度（X3）一定时，将料液比（X2）增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到达最高之后，山核桃蛋白的浸出率会随着料液比（X2）的升高而降低，而且在不同碱提温度（X3）时，其变化趋势是不同的，当碱提温度（X3）较低时，尽管料液比（X2）升高，但山核桃蛋白的浸出率处于较低水平；在料液比（X2）的各个水平下，料液比（X2）和碱提温度（X3）呈抛物线关系。即在一定的料液比（X2）下，当碱提温度（X3）逐渐增加时，山核桃蛋白的浸出率随碱提温度（X3）逐渐增加后又降低，主要是由于较高的温度会导致蛋白变性；两者的相互影响表明，选取适宜的料液比（X2）和碱提温度（X3）可使山核桃蛋白有较高的浸出率。

2.7 提取工艺的优化

由实验结果分析可知，在实验中不但存在着单因素效应，而且还有因素间的交互作用，因此很难从单因素效应和交互作用的结果分析中找到最佳提取条件，并且三元二次回归的数学模型不存在提取率函数的极值，同时考虑到本实验中温度不宜过高、pH不宜过大等因素，因此需对回归模型进行再解析，本实验采用频率分析法分析回归模型以找到最佳提取条件，结果见表5。

表5 各变量取值的频率分布Table 5 The probability distribution of values of each variable

由表5可知，在95%的置信区间山核桃蛋白提取效率大于50.53%时各变量的取值区间分别为0.962～1.315、-0.105～0.589、0.222～0.761，即pH为9.0～9.2、料液比为1∶24.5～1∶27.9、碱提温度为56.1～58.8℃，在此范围内，考虑到实际的可操作性，可将最佳工艺条件定为：pH9.0、料液比1∶25、碱提温度为57℃，在此条件下预测值为57.04%，用此最优提取条件对其进行验证，得山核桃蛋白提取率为56.88%，与预测值较为接近，表明本实验结果拟合得出的回归方程可以较好地应用于山核桃蛋白的提取。

3 结论

3.1 山核桃蛋白提取率的数学回归模型

采用二次正交旋转组合设计，以山核桃饼粕为原料提取山核桃蛋白，以影响山核桃蛋白提取率的pH（X1）、料液比（X2）、碱提温度（X3）几个因素为实验因素设计安排实验，得到了三元二次数学回归模型：Y=52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.93853X22-1.82772X32。

3.2 山核桃蛋白提取的最佳工艺的确定

对数学模型进行优化可知，山核桃蛋白提取率大于50.53%的最优提取条件为pH为9.0～9.2、料液比为1∶24.5～1∶27.9、碱提温度为56.1～58.8℃。在此范围内，考虑到实际的可操作性，可将最佳工艺条件定为：pH9.0、料液比1∶25、碱提温度为57℃，在此条件下预测值为57.04%，用此最优提取条件对其进行验证，得山核桃蛋白提取率为56.88%，与预测值较为接近，说明数学模型对山核桃蛋白的提取工艺是可行的。

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Study on extraction process of protein isolation from pecan cake

YANG Jin，DONG Ming*，CAO Bin-bin，ZHAO Xiao-jia
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Pecan meal as raw material，with the extraction technology of alkali solution and acid precipitation，alkalipH，solid-liquidratioandalkalitemperature were taken as test factors.Then regression model was established to aim at leaching rate of pecan protein and obtaining the best extraction technology by orthogonal rotation. The results showed that the best pecan meal extraction technology was as follows：pH was 9.0，solid to liquid ratio was 1∶25 and temperature alkali was 57℃，the extraction rate could reach 56.88%under this condition.

pecan protein；orthogonal rotation；extraction technology

TS201.1

B

1002-0306（2012）05-0280-05

2011－05－09 *通讯联系人

杨瑾（1986-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。