牛奶过敏原PCR检测方法的建立

许庆金，邓志瑞，张文举，陈 沁

(上海大学生命科学学院，上海200444)

牛奶过敏原PCR检测方法的建立

许庆金，邓志瑞，张文举，陈 沁*

(上海大学生命科学学院，上海200444)

牛奶是主要的食品过敏原之一，其中β－乳球蛋白是引起牛奶过敏的主要成分。基于牛奶β－乳球蛋白基因序列设计一对PCR引物，经过反应条件的优化，建立了适合检测牛奶β－乳球蛋白过敏原的PCR方法。实验结果表明，当PCR反应体系中模板DNA量为25ng，引物浓度为4mmol/L时，检测效果最佳。所建立的方法不仅可用于不同保质期、不同来源牛奶β－乳球蛋白过敏原的测定，亦可用于牛、羊奶不同比例混合物中β－乳球蛋白过敏原的检测。

β－乳球蛋白，PCR，牛奶过敏原

食物过敏(food allergy)是食物刺激有机体产生的变态反应［1］，微小的剂量即可在几分钟之内引起皮肤以及肠道等的疾病，严重者甚至导致休克死亡。发达国家每年有超过20%的人受过敏性疾病的困扰。联合国粮食及农业组织(FAO，995)报告的八类主要的过敏原食物是牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹)、大豆、花生、核果类(杏、板栗、腰果)以及小麦。牛奶是其中最常见的过敏原之一，在小于3岁的婴幼儿中发病率为1.6%～2.8%［2］。而β－乳球蛋白是牛奶致敏的主要成分［3］。牛奶过敏已引起社会的关注，日本、澳洲和西方国家要求含有牛奶成分的食品必须标明牛奶过敏标示［4－5］。目前，牛奶过敏原的检测方法主要有基于蛋白质检测的SDS－PAGE、HPLC和HPLC－MS等［6－7］。这些方法本可直接检测到过敏原蛋白，但在食品加工过程中，蛋白质空间构象易被破坏，从而影响检测准确性，目前已有研究证实变性后的部分蛋白可与抗体结合引起假阳性［8－9］;此外，上述方法存在检测周期较长、不稳定因素多、工作量大等缺点［10］。PCR技术在食品检测中的成功应用在一定程度上可解决上述问题。鉴于此，本文针对牛奶中引起过敏的β－乳球蛋白对应的基因序列设计引物，拟建立检测牛奶过敏原的PCR方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛奶和羊奶 好又多超市;dNTPs、Taq酶和10 ×PCP buffer(Mg2+plus) 天根生物科技(北京)有限责任公司;引物 由上海生工生物工程有限公司合成;TEN溶液 1mL Tris－HCl溶液(1mol/L，pH 7.4)+0.2mL EDTA溶液(0.5mol/L)+0.5844g NaCl固体，定容至100mL;其他试剂 按常规方法配制。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取 牛奶DNA的提取参照徐仙等［11］、田雨［12］及Sharma D等［13］的方法，稍作修改。

a.取35mL牛奶(羊奶)置于50mL洁净的离心管中，4℃，3000r/min离心10min，弃上清液，在超净台中用脱脂棉球小心拭去管壁上的脂类物质;b.加10mL PBS溶液，溶解沉淀，4℃，3000r/min离心10min，弃上清液，再次在超净台中用脱脂棉球小心去脂;c.4℃，10000r/min离心1min，去上清液;d.加440μL TEN溶液和60μL NaOH溶液，转入无菌的 Eppendorf管(1.5mL)中，置于95℃条件下8min，冷却5min，4℃，10000r/min离心 5s，转移上清至新的无菌的Eppendorf管(1.5mL)中;e.加等体积SEVGA(氯仿∶异戊醇 =24∶1)，混合混匀，4℃，12000r/min离心10min，取上清液;f.加等体积(－20℃)预冷的异丙醇，－20℃放置40min，13000r/min离心15min，弃上清液;g.加300μL 70%乙醇，12000r/min离心5min，去上清液;h.加50μL双蒸水，测DNA浓度和纯度，分装，低温(－20℃)保存。

1.2.2 PCR引物设计 针对牛β－乳球蛋白基因设计引物 FCM/RCM，序列见表 1，目的条带大小为1.8kb。

1.2.3 PCR反应体系和条件 PCR扩增反应总体系20μL，包含2μL PCR buffer(Mg2+plus)，3.2μL dNTP (2.5mmol/L)，2μL DNA模板，1μL引物(each 3μmol/L)，0.4μL Taq酶(2.5U/mL)，10.4μL双蒸水;同时设置空白对照，即在20μL PCR体系中使用等量双蒸水代替DNA。

PCR反应条件为:94℃预变性4min，94℃变性30s，68℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观察结果。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

2 结果与分析

2.1 DNA浓度对PCR结果的影响

分别选取不同量的DNA(5、10、15、20、25、50ng)为模板，以FCM/RCM为引物进行PCR扩增，电泳结果见图1。由图1可知，当DNA含量低于15ng时无目的条带出现，15ng时开始出现目的条带但较弱，加大DNA用量时，目的条带愈加清晰。当DNA用量为50ng时，模板中的杂质含量也同时上升，此时PCR扩增也易受杂质干扰出现杂带，因而选用25ng为后续实验的DNA用量。

图1 DNA浓度对PCR扩增的影响Fig.1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

2.2 引物浓度对PCR扩增的影响

DNA用量为25ng时，设定引物FCM/RCM的不同浓度(1、2、3、4、5、10、20mmol/L)进行PCR扩增，电泳结果如图2所示。由图2可知，引物浓度为1mmol/L时，无目的条带扩增;增大至2mmol/L和3mmol/L时，目的条带清晰度较低;当引物浓度为4mmol/L时，目的条带较清晰;大于4mmol/L时，开始有微弱的非特异性杂带出现，且随着引物浓度的增大，非特异性趋于明显，综上所述，选择4mmol/L作为最终的引物浓度。

图2 引物浓度对PCR扩增的影响Fig.2 Effect of primer concentrations on PCR amplification

2.3 保质期对PCR扩增的影响

取不同保质期的品牌A牛奶(7、21、45、180d)提取DNA，进行PCR扩增，电泳结果见图3。由图3可知，保质期7d的A品牌鲜牛奶目的条带最强，保质期21d的目的条带强度次之，保质期45d的纯牛奶条带最弱，保质期180d的A品牌纯牛奶没有PCR扩增。

图3 保质期对PCR扩增的影响Fig.3 Effect of shelf lives on PCR amplification

2.4 不同品牌牛奶的PCR扩增结果

在优化PCR体系后，分别取四种不同品牌的鲜牛奶(A、B、C、D)提取DNA，进行PCR扩增电泳，结果如图4所示。由图4可见，四种品牌的牛奶均出现了目的条带，且条带的差异不大，说明不同品牌的鲜牛奶中均含有此种过敏原。

2.5 牛奶过敏原PCR检测方法的特异性

为考察所建立的PCR检测方法的特异性，以A品牌纯牛奶DNA模板为阳性对照，分别取不同品牌的羊奶(顶羊，御宝，阳春)提取DNA，进行PCR扩增，实验结果如图5所示。由图5可知，A品牌纯牛奶(21d)出现了清晰的目的条带，而不同来源的羊奶未出现相应目的条带，表明引物FCM/RCM具有较好的特异性。

2.6 A品牌纯牛奶和顶羊纯羊奶混合物的PCR检测

将A品牌纯牛奶(21d)和顶羊羊奶(30d)按不同比例(牛奶∶羊奶=0.5∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1)混合，上述混合物提取DNA，PCR扩增结果如图6所示。由图6可见，目的条带随着牛奶比例的提升从无到有，从弱到强;在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V)时开始出现微弱的目的条带;4∶1、5∶1和10∶1时，目的条带较为清晰。

图4 不同品牌牛奶PCR扩增结果Fig.4 PCR results of different brands milk

图5 A品牌纯牛奶和不同品牌羊奶PCR结果Fig.5 PCR results of brand A pure milk and different brands goat milk

图6 A品牌纯牛奶和顶羊纯羊奶混合物PCR结果Fig.6 PCR results of mixture of brand A pure milk and Dingyang pure goat milk

为进一步确认PCR检测方法的临界点，在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V，下同)附近设置了更多的混合比例(牛奶∶羊奶=1.5∶1，2∶1，2.2∶1，2.4∶1，2.6∶1，2.8∶1，3∶1)，PCR扩增结果如图7所示。由图7可知，在牛奶∶羊奶=2.6∶1(V/V)时，目的条带开始出现但较弱;小于2.6∶1的比例混合时，没有目的条带出现，可以初步认定在本实验条件下，牛奶∶羊奶=2.6∶1 (V/V)为检测的临界值。

图7 不同比例混合的牛奶和羊奶PCR结果Fig.7 PCR results of mixture with different ratios of milk and goat milk

3 讨论

DNA和引物的用量是影响PCR扩增的重要因素，只有在适宜的浓度范围内才能得到理想的扩增条带［14－15］。过低的DNA模板量和引物用量使得扩增效率低下甚至扩增不出对应的目的条带;DNA过量时引物会过早耗尽，使得扩增产物与模板DNA之间发生退火或者扩增产物之间发生退火，导致出现弥散状背景［15］;过高的引物用量倾向于形成非特异性产物，同时形成大量引物二聚体。所以本实验考察了模板量和引物用量对PCR扩增的影响，结果证实随着DNA量的增加，目的条带呈现增强的趋势;在15ng以下几乎检测不到牛奶过敏原的存在;DNA用量为25ng时可以得到较为清晰、分辨率较高的条带;在设定的7个引物浓度梯度中，最佳引物用量为4mmol/L。

实际商品检测中，不同处理(加热、酸碱等)方式及保存方式对DNA提取和PCR检验结果也会有一定影响［14，16－17］。Gawienowski M C等［16］研究表明，经浸泡、湿磨等加工过程能使玉米基因和质粒DNA降解，135℃加热2h后，DNA几乎完全降解;Kharazmi M等［17］认为，浸泡后又经过物理破碎处理而做成的豆奶、豆腐和热加工做成的玉米糊和马铃薯，没有检测出大于1.1kb的DNA片段。本实验提取不同保质期的牛奶DNA，同等模板量进行PCR扩增，结果表明不同保质期的牛奶PCR结果有一定差异。

PCR方法的特异性主要体现在特异引物与靶基因的专一、有效的结合上，而与其他相似的序列无法进行结合［18］。在牛奶和不同品牌羊奶的对照实验中，结果显示引物FCM/RCM不会与羊奶基因组DNA发生特异性结合，无目的条带产生，这说明本方法特异性较好。因此，本方法可用于牛奶过敏原的特异性检测。

与牛奶相比，羊奶中的β－乳球蛋白的含量比牛奶低，且氨基酸排列顺序与牛奶不同，较牛奶更易消化，因此羊奶可以解除大部分牛奶过敏症［19］;但是羊奶产量较低，因此有不法商家将牛奶掺杂进羊奶销售，此种混合物难以用肉眼进行区分，所以本文按不同比例将牛奶混合进羊奶之中，使用本文建立的PCR方法检测羊奶之中的牛奶含量。结果表明，当牛奶∶羊奶比例为2.6∶1(V/V)时，能检测出来羊奶之中的牛奶成分，更多这方面的应用正在进一步的实验中。

［1］Johansson S G，Bieber T，Dahl R，et al.Revised nomenclature for allergy for global use:report of the Nomenclature Review Commol/Littee of the World Allergy Organization，October 2003［C］.J Allergy Clin Immol/Lunol，2004，113:832－836.

［2］Besler M，Eigenmann P，Schwartz R H.Allergen data collection－Update:Cow’s Milk［C］.Internet Symposium on Food Allergens，2002(4):19－106.

［3］Natale M C，Bisson G，Monti A，et al.Cow’s milk allergens identification by two－dimensional immol/Lunoblotting and mass spectrometry［J］.Mol Nutr Food Res，2004，48:363－369.

［4］Swiss Food Law:Art.8 Abs.1 der Verordnung u¨ber die Kennzeichnung und Anpreisung von Lebensmitteln［S］.2005，23 (11).

［5］Directive 2003/89 EC of the European Parliament and Council and its Annex IIIa［S］.

［6］Wal J M，Bernard H，Yvon M，et al.Enzyme immol/Lunoassay of specific human IgE to purified cow’s milk allergens［J］.Food Agric Immol/Lunol，1995(7):175－187.

［7］Wal J M.Cow’s milk proteins/allergens.Ann Allergy Asthma Immol/Lunol［J］.2002，89:3－10.

［8］Kleber N，Maier S，Hinrichs J.Antigenic response of bovine β－lactoglobulin influenced by ultra－high pressure treatment and temperature［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2007(8):39－45.

［9］Bugyi Z，Nagy J，k Törö K，et al.Towards development of incurred materials for quality assurance purposes in the analysis of food allergens［J］.Analytica Chimica Acta，2010，672:25－29.

［10］Van Hengel A G.Food allergen detection method sand the challenge to protect food－allergic consumers［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，389:111－118.

［11］徐仙，陈沁，雍克岚，等.PCR方法在区分牛奶牧场来源中的应用［J］.食品科技，2008，33(12):258－261.

［12］田雨.从牛奶中分离DNA方法的建立［J］.乳业科学与技术，2006，118(3):112－113.

［13］PirondiniA，BonasU，MaestriE，etal.Yieldand amplificability ofdifferentDNA extraction procedures for traceability in the dairy food chain［J］.Food Control，2010，21: 663－668.

［14］王渭霞，赖凤香，洪利英，等.转基因水稻DNA样品浓度以及存放条件对PCR定性检测的影响［J］.农业生物技术学报，2010，18(5):846－852.

［15］李苗，高丽美，李永锋，等.增强UV－B辐射对小麦幼苗基因组DNA的影响及RAPD分析体系的建立［J］.生物技术通报，2010(5):87－92.

［16］Gawienowski M C，Eckhoff S R，Ping Y，et al.Fate of maize DNA during steeping wet milling and processing［J］.Cereal Chem，1999，76(3):371－374.

［17］Kharazmi M，Bauer T，Hammol/Les W P，et al.Effect of food processing on the fate of DNA with regard to degradation and transformation capability in Bacillus subtilis［J］.Syst Appl Microbiol，2003，26(4):495－501.

［18］Carl W Dieffenbach，Gabriela S Dveksler.PCR Primer:A laboratorymanual［M］.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.

［19］邵国峰，兰毅楠，曲晟，等.羊奶与牛奶比较有何优缺点［J］.农家之友，2009，272(13):75.

PCR method for the detection of allergen in milk

XU Qing－jin，DENG Zhi－rui，ZHANG Wen－ju，CHEN Qin*
(School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China)

Milk is considered to be a kind of important allergen，and β－lactoglobulin is one major component of allergens in milk.A pair of primers was designed based on the gene sequence of β－lactoglobulin in milk and PCR reaction system was optimized for detecting β－lactoglobulin allergen.The results showed that best results could be obtained by combining 25ng template DNA with 4mmol/L primers used for PCR analysis.The established method can not only be successfully applied in detecting β－lactoglobulin allergen in milk from different shelf lives，and resources，but also in detecting the allergen in the mixture at different ratios of cow milk and goat milk.

β－lactoglobulin;PCR;milk allergen

TS207.3

A

1002－0306(2012)06－0104－04

2011－05－18 *通讯联系人

许庆金(1984－)，男，在读研究生，研究方向:食品安全检测。