PCR法定性检测大豆食用油中转基因成分

周红霞，华 春，张红琳，李俊芳，祝长青，黄 明，周光宏，*

（1.南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京210095; 2.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171; 3.江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001）

PCR法定性检测大豆食用油中转基因成分

周红霞1，2，华 春2，张红琳2，李俊芳2，祝长青3，黄 明1，周光宏1，*

（1.南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京210095; 2.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171; 3.江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001）

针对大豆食用油中核酸含量低且被严重破坏、DNA难以提取的问题，对CTAB法进行优化，有效从食用油中提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板。同时定性检测出大豆内源基因lectin，外源调控序列启动子CaMV35S、终止子Nos及目的基因CP4－EPSPS序列，成功建立了基于PCR技术在大豆食用油中快速检测转基因成分的方法。

大豆食用油，转基因检测，DNA提取，PCR

由于转基因生物（GMO）具有抗逆性，产量高，生产成本相对较低，具有较好的市场竞争性和应用前景，故随着转基因技术的飞速发展，加速了转基因产品的市场化、商品化，使其具有较好的市场竞争性及应用前景［1］。但转基因生物的广泛应用是否会对生态环境和人类生物的健康造成不良影响，至今仍无定论［1］。据此，欧盟、日本等国家先后制定了转基因食品标识管理政策，以保护消费者的知情权和选择权。我国也要求从2002年3月20日起标识市售转基因大豆、玉米、油菜、番茄、棉花及其加工产品［2］。PCR的技术手段由于其高效性而成为转基因食品的最常用检测方法［3－7］。国际通用方法是以PCR技术为平台，通过特异扩增转基因调控原件花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子、胭脂碱合酶（NOS）终止子以及目的基因抗除草剂基因CP4－EPSPS来筛选检测转基因食品［3－7］。食用油作为一种精深加工食品，经过240℃高温和高压等加工步骤之后，核酸严重破坏，且含量低，提取困难，成为限制检测其中转基因成分的瓶颈［8－19］。另外食用油的主要成分是脂类物质，水溶性的DNA含量相当少，因此精炼油中DNA的提取重点是如何有效富集其中的微量DNA。国内外有食用大豆油转基因检测的报道，但多采用试剂盒的方法［8－18］，栾凤侠［12］比较了CTAB法和W izard试剂盒法提取精炼大豆油DNA的效果，结果表明试剂盒法提取效果优于CTAB法。程红梅［15］采用了离心柱法从10m L大豆油中提取到0.4μg的DNA，白立群［17］采用冷冻干燥法从20m L食用油中提取到可用于检测的DNA。Paul［20］和Zhang［21］，分别采用W izard试剂盒法及W izard Magnetic DNA Purification System for Food Kit（Promega）试剂盒提取大豆油中DNA，均认为大豆精炼油中不能提取出DNA，因此如何高效提取精炼油中的DNA始终是转基因检测的瓶颈难点。尽管油脂中转基因成分的检测已有相关国家标准出台，但作者通过多次实验发现，标准中介绍的方法并不能完全有效地提取油脂中DNA。我们参照前人介绍的方法［11－18］，对其中的某些步骤进行了改进，结果发现，改进的方法较之于标准方法，其DNA提取的有效性大大提高，所提取的DNA完全能够用于后续的PCR检测，并通过PCR扩增CaMV35S启动子、NOS终止子以及抗除草剂基因CP4－EPSPS来定性检测转基因食用油，为大豆深加工食品的转基因检测提供切实可行的基础。

表1 检测不同基因所用引物及产物大小Table 1 List of different specific primer and the size of their product

表2 PCR反应条件Table 2 PCR reaction conditions

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福临门一级大豆食用油、豆维家大豆食用油、金龙鱼大豆食用油 均从超市购得;转基因大豆、非转基因大豆 江苏出入境检验检疫局惠赠;CTAB、Tris、SDS、Taq酶、核酸共沉淀剂（DNAmate）、引物上海生工。

凝胶成像仪GelDoc 2000 system 美国BioRad公 司;Mastercyclerep personal PCR 仪 德 国Enpendorf公司;水平电泳仪 北京百晶生物技术有限公司;Ultraturrax T25高速匀浆器 德国 IKAWERKE公司。

1.2 引物

大豆食用油中Lectin内源基因、CaMV35S启动子基因、NOS终止子基因、CP4－EPSPS外源基因的引物序列见表1［19］。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆食用油中DNA的提取 参照前人方法［11－18］，取1m L食用油到2m L离心管中，加入400μL的TE缓冲液，颠倒摇匀5m in，常温13000 r/min离心3min，去除上层油脂层，在同一只离心管中再加入1m L的食用油，颠倒摇匀5m in，常温13000 r/m in离心3m in，去除上层油脂层，以上步骤重复15～20次。取水相转移至新的 2m L离心管中，在水相中加400μL的CTAB提取液和2μL的RNA酶，涡旋震荡1～3s，65℃水浴30m in后加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24∶1），轻缓颠倒数次后静置 5m in，常温13000 r/min离心3m in，转移上清液置于另一个2m L的离心管中。加入上清液 1/10体积的3mmol/L NaAc（pH 5.2）溶液，均匀混合，再加入4μL的DNA共沉淀剂溶液，均匀混合。转移离心管中一半的溶液于另一个新的2m L离心管中，分别加入2.5倍体积的－20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，12000 r/m in 4℃条件下离心20min，弃溶液，留白色沉淀。加入－20℃预冷的70%乙醇1m L，洗涤沉淀两次。12000 r/m in 4℃条件下离心5m in后小心弃去乙醇，自然干燥。每个离心管中加30μL 0.1×TE缓冲液溶解沉淀，4℃保存备用。以去离子水作空白对照。

1.3.2 PCR检测大豆食用油DNA的转基因成分

1.3.2.1 PCR反应体系及反应条件 反应体系:10× PCR Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，dNTP 2.5mmol/L 2.0μL，20pmol/μL引物（正:0.25μL，反: 0.25μL），5U/μL Taq酶0.125μL，DNA模板通常取量为2～5.0μL，所补超纯水量随DNA模板量而变化，最终补足25μL。PCR反应条件见表2，同时设阳性对照、阴性对照、空白对照。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 取5μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，缓冲液为用1×TAE电泳缓冲液，在5V/cm电压中电泳20m in，凝胶成像系统观察结果。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取

将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果没有条带出现（结果未显示），分析原因是由于食用油脂中DNA含量非常低，以致常规的凝胶电泳无法显示。因为提取过程加入核酸共沉淀剂，因此提取后的目标DNA含量及纯度无法用紫外分光光度法确定，紫外所获取的OD值，都可能是核酸共沉淀剂和目标DNA的混合信息。

2.2 大豆内源基因Lectin的检测

Lectin基因是大豆所特有的内源性基因，任何以大豆为原料制备的产品均应含有该基因。检测内源基因可以判断从食用油中是否成功提取到DNA，以及所提取的DNA是否适合于PCR扩增，同时还可以判断所提取的DNA是否含有PCR扩增抑制物，从而避免结果出现假阴性。按表2的PCR条件首先检测了Lectin基因，以水代替DNA模板为空白对照，以非转基因大豆为阴性对照，以转基因大豆为阳性对照，以提取过程中添加的DNA共沉淀剂代替DNA模板作为对照，排除其引物模板的可能性。图1显示了大豆内源基因Lectin的检测结果，三种油、转基因大豆、非转基因大豆均能扩增出约118bp左右的片段，说明所提取的DNA质量较好，可用作PCR检测模板。DNA共沉淀剂在PCR检测中无新条带出现，说明其增加了提取效率但并没有引入外源基因，可以作为安全的DNA共沉淀剂。第六泳道阳性对照扩增的条带亮度低于三种大豆食用油的主要原因为阳性对照DNA和食用油中DNA提取时间不一致，阳性对照大量提取一次，存放备用，可能存放的时间比较久。

图1 PCR检测大豆油内源基因LectinFig.1 PCR amplification results of endogenous Lectin in DNA sample of soybean oil

2.3 大豆食用油中外源基因的检测

外源基因的检测通常包括两方面:一是调控基因的检测，另一个是目的基因的检测。首先我们对调控基因CaMV35S启动子和NOS终止子按表2的PCR条件进行扩增检测，结果见图2和图3。由此可以看出转基因大豆和三个品种的大豆食用油均能扩增出约195bp的CaMV35S启动子（图2）和约180bp的NOS终止子片段（图3）。

图2 大豆食用油CaMV35S启动子的PCR检测Fig.2 PCR amplification results of CaMV35S promoter in DNA sample of soybean oil

图3 大豆食用油NOS终止子的PCR检测Fig.3 PCR amplification results of NOS terminator in DNA sample of soybean oil

由于CaMV35S启动子来源于花椰菜花叶病毒，NOS终止子来源于根癌农杆菌，因此若原料大豆被花椰菜花叶病毒或被根癌农杆菌侵染，就会有假阳性出现。因此除了检测调控基因还要检测目的基因CP4－EPSPS才能下最终结论。

利用改进方法提取的三个品种大豆食用油中的DNA，用CP4－EPSPS引物按表2的PCR条件进行扩增，以水代替DNA模板为空白对照，以非转基因大豆为阴性对照，以转基因大豆为阳性对照，结果见图4。由图4可以看出，所提取的DNA可以成功检测到目的基因CP4－EPSPS320bp片段，且扩增出的片段与转基因大豆一致，而非转基因大豆和水空白对照均未检测出该片段。据国内检测机构反映，通常在精炼食用油中能检测到35S启动子和NOS终止子，但是检测不到CP4－EPSPS目的基因，因此，本研究所建立的大豆食用油DNA提取方法简单方便，可用于大豆深加工DNA提取的检测。

3 讨论

精炼油中DNA提取的重点是如何有效地富集大豆油中微量DNA，本文在前人基础上分别对DNA提取和PCR检测作了如下改进，取得了满意的检测效果。

a.提取样品的初始量是能否成功提取DNA的关键因素。文献［9－11］中报道的1～5m L的样品量难以提取到可供PCR检测的DNA量，当样品量增加到20m L时，可成功检测到（见图1～图3）。

图4 大豆油目的基因CP4－EPSPS的PCR检测Fig.4 PCR amplification results of CP4－EPSPS in DNA smample of soybean oil

b.提取开始前利用DNA可溶于水溶液的特性，在食用油脂中加入一定体积的TE溶液进行洗涤以萃取其中含量极少的DNA;另外颠倒摇匀时切忌剧烈震荡，否则会破坏DNA。

c.为了提高食用油中DNA的沉淀效果可加入核酸共沉淀剂，共沉淀剂最好选择与目标DNA相差较远的物种，以本研究所用的核酸共沉淀剂作为PCR反应的阴性对照，结果发现不干扰待测目标片段的检出（见图1第6泳道）。

d.沉淀DNA的步骤中加入NaAc，NaAc提供弱酸环境，可促使DNA沉淀。

e.本文研究中发现，为了提高CP4－EPSPS基因检出成功率，目的片段的稳定性比长短更重要。本文曾经选择170bp大小的目的片段，但没有检测到（结果未显示），最后选择富含GC碱基对的823－1143序列作为检测目的片段，PCR最终获得成功（见图4），分析可能的原因是，这段序列富含GC，在加工中稳定性好，不容易被破坏，所以虽然目的片段变长，但依然可以成功检测到。这一发现可应用于其他深加工转基因食品的检测中。

本研究成功建立了基于PCR技术在大豆食用油中快速检测转基因成分的方法。该方法所检测的CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4－EPSPS等基本覆盖了世界上已商品化的转基因大豆及其深加工产品，因此所建立的检测体系具有通用性，该方法利用大豆内源基因Lectin作为内参照，可以直接检测提取的DNA质量，同时设立了阳性质控、阴性质控和空白对照，从而避免了假阴性、假阳性以及污染可能造成的假性结果，保证了检测结果的准确性、可靠性，基本满足各国及地区定性检测，在筛选过程中若为阴性的样品，可直接判断为阴性，若为阳性，可进一步做鉴定检测。

［1］金芜军，贾士荣，彭于发.不同国家和地区转基因产品标识管理政策比较［J］.农业生物技术学报，2004，12（1）:1－7.

［2］中华人民共和国农业部令第10号.农业转基因生物标识管理办法［S］.2002.

［3］Su WJ，Song SY，Long MN，et al.Multiplex polymerase chain reaction/menmbrene hybridization assay for detection of genetically modified organisms［J］.Journal of Biotechnology，2003，105:227－233.

［4］Dinko Mijenko Huzak，Marija Curlin，et al.An improved method for determination ofgene copy numbers in transgenicmice by serial dilution curves obtained by real time quantitative PCR assay［J］.JBiochem Biophys Methods，2005，64:83－98.

［5］Alary，Amaud Serin，Delphine MAURY，et al.Comparison of simplex and duplex real－time quantification of GMO inmaize and soybean［J］.Food Control，2002（13）:235－244.

［6］Dmitrdsse，Despnapk，Kyriakig，et al.Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms［J］.Anal Bioanal Chem，2008，392（3）: 347－354.

［7］Lippm，Anklam E，Stave JW.Validation of an immunoassay for detection and quantification of a genetically modified soybean in food and feed fractions using reference materials: Interlaboratory study［J］.Joumal of AOAC International，2000，83:919－927.

［8］金红，赵昕，王永，等.转基因作物深加工产品的DNA提取方法研究［J］.华北农学报，2006，21（2）:53－56.

［9］王澎，金丽晨，耿志明，等.食用大豆油中DNA的快速提取和转基因成分定性检测［J］.江苏农业学报，2008，24（6）: 940－943.

［10］邓鸿玲，覃芳芳，郭新东，等.食用大豆油中转基因成分的检测［J］.中国油脂，2007，32（8）:79－81.

［11］覃文，董洁，邓鸿玲，等.PCR法定性检测食用油脂中转基因成分食品中转基因成分的检测［J］.中国油脂，2002，27 （2）:4－6.

［12］栾凤侠，张洪祥，白月.食用油脂中DNA高效快速提取方法及实时荧光PCR检测技术的研究［J］.中国油脂，2005，30 （7）:41－43.

［13］覃文，董洁，高东威，等.食品中转基因成分的检测［J］.食品科学，2001，22（7）:59－62.

［14］徐伟丽，杜明，徐德昌.色拉油中转基因成分的PCR检测［J］.生物信息学，2009，7（3）:238－242.

［15］程红梅，彭于发，金芜军，等.一种快速、简便提取大豆油DNA的方法及转基因大豆油的检测［J］.中国农业科学，2007，40（5）:1069－1072.

［16］许冬倩，郝义波.一种有效的油脂DNA的提取方法［J］.食品研究与开发，2008，29（10）:42－45.

［17］白立群，吴亚君，等.一种有效的大豆精炼油DNA提取新方法—冷冻干燥法［J］.食品与发酵工业，2009，35（12）: 155－159.

［18］Gryson N，Ronsse F，Messents K，et al.Detection of DNA during the refining of soybean oil［J］.JAOCS，2002，79（2）: 171－174.

［19］Wolfram Hemmer.Primer sequences and amplicon length in PCR－assays to detect GMOs.NY［DB/OL］.2002－08.http:// www.bats.ch/abstr/table14.htm.

［20］Pauli U，Liniger M，Zimmermann A.Detection of DNA in soybean oil［J］.Z Lebensm Unter Forsch A，1998，207:264－267.

［21］Zhang M H，Gao X J，Yu YB，et al.Detection of Roundup Ready soy in highly processed products by triplex nested PCR［J］.Food Control，2007（18）:1277－1281.

Detection of genetically modified com ponents in soybean oil by PCR

ZHOU Hong－xia1，2，HUA Chun2，ZHANG Hong－lin2，LI Jun－fang2，ZHU Chang－qing3，HUANG M ing1，ZHOU Guang－hong1，*
（1.National Center of Meat Quality and Safety Control，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.School of Biochemical and Environmental Engineering，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171，China; 3.Nanjing Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

A qualitative m ethod for detecting of transgenic genes in ed ib le oils was reported.It was norm ally considered that ed ib le oils，especially refining oils，w ith low content DNA，RNA and p roteins.A usefulmethod for extrac tion DNA from the ed ib le oilsam p les was estab lished，it could be used as tem p late for PCR.The endogenous genes（Lec tin）and transgenic genes（CaMV35S，Nos，CP4－EPSPS）were detec ted in the ed ib le oil sam p les by the PCRmehtod.

soybean oils;detection GMO;DNA extrac tion;PCR

TS207.3

A

1002－0306（2012）06－0087－05

2011－04－26 *通讯联系人

周红霞（1976－），女，副教授，博士后，研究方向:食品生物技术。

农业部《转基因重大专项》（2009ZX08012－014B）;江苏省教育厅高校自然科学与研究项目（10KJD550005）。