膜生物反应器封闭循环发酵系统对野生酵母的驯化

胡 亮，丁文武，张 丽，王 伟，肖泽仪

（四川大学化学工程学院，四川成都 610065）

膜生物反应器封闭循环发酵系统对野生酵母的驯化

胡 亮，丁文武，张 丽，王 伟，肖泽仪*

（四川大学化学工程学院，四川成都 610065）

自然界中选育的野生酵母菌S3在PDMS膜生物反应器长期封闭循环系统中进行驯化，在经过3轮连续的封闭循环发酵适应性驯化实验后，对第四轮实验和第一轮实验的酵母发酵性能进行比较，分析野生酵母的适应性进化行为，乙醇－细胞平均比产率、葡萄糖转化率分别提高42.6%、2.1%，细胞平均死亡率减少11.04%;与商用的安琪酵母（ADY）相比，发酵性能也更优秀。结果表明在膜生物反应器封闭循环发酵系统中可以使野生酵母菌得到驯化。

PDMS膜生物反应器，野生酵母，长期封闭循环发酵，驯化

PDMS膜生物反应器封闭循环发酵工艺具有运行时间长、副产物积累量大的特殊性，要获得优化的发酵操作工艺性能，酵母微生物是关键。而适应这种工艺的酵母菌种将不同于传统发酵工艺所用酵母菌种［1］。通过适应性驯化选育优良酵母微生物是普遍采用的方法［2－6］。为了选育、驯化得到更适应PDMS膜生物反应器封闭循环发酵工艺的酵母菌，我们曾经在前期的工作中对商用工业酵母菌（湖北安琪酵母公司的耐高温酿酒活性干酵母TH－AADY）进行培养驯化实验［7］。基于遗传基因相对纯洁容易产生突变的原理，本文以自然界中分离得到的野生酵母菌S3为起始菌种，在PDMS膜生物反应器中进行4轮发酵周期为500h的长期封闭循环发酵，培养、驯化和选育适应性的优良菌种，并与起始菌种为TH－AADY的驯化菌株进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

耐高温酿酒干酵母（TH－AADY） 湖北安琪酵母公司;野生酵母菌S3 本实验室筛选获得;纯净水

实验室自制;葡萄糖 内蒙古阜丰生物科技有限公司;酵母膏 北京奥博星生物技术有限责任公司; （NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

Anke－TDL－5－A离心机 上海安亭科学仪器厂;DMA4500密度仪 Anton Paar Austria;202AB－1恒温干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;AR2130/ C电子天平 OHAUS USA;AV400全自动生化分析仪 Olympus。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌种 自然界筛选获得的野生酵母菌S3，详细菌种筛选过程见参考文献［1］。

耐高温酿酒干酵母，在35～40℃的自来水或2%糖水中溶解，复活15～20m in直接投入发酵罐中发酵，无需培养。

1.2.2 培养基 基础发酵培养基的组成（g/L蒸馏水）:葡萄糖 100;酵母膏 1.6;（NH4）2SO410.0; KH2PO43.0;MgSO4·7H2O 1.1;CaCl20.3;其中除葡萄糖为工业级外，其他成分均为试剂级。

将培养基组分溶解后，高温灭菌，冷却到常温后混合备用。

1.2.3 膜及膜组件 本实验采用的膜以及膜组件都是由实验室自行设计、制备和安装，详细见参考文献［7－9］。

1.2.4 酵母菌的驯化

1.2.4.1 装置和流程 实验采用的PDMS膜生物反应器封闭循环系统详细见参考文献［7－9］。系统主要由三部分构成:发酵罐、膜组件、冷凝收集装置。

1.2.4.2 实验程序 将自然界筛选的野生酵母菌S3作为起始菌株，进行第一轮500h（21d）的封闭循环发酵，从发酵残液里分离筛选出优势菌种，转移培养制成新的种子液，接种到PDMS膜生物反应器系统进行第二轮的500h发酵，如此重复执行发酵－筛菌－转移培养的实验操作程序，共4个轮次。封闭循环发酵实验时，每天（8:30am～7:30pm）启动渗透汽化膜分离，及时提取产物乙醇，并根据乙醇生产量和基质糖的消耗量添加原料葡萄糖;晚上（7:30pm～8:30am）则既不启动膜分离，也不及时添加葡萄糖，但在白天膜分离操作结束时会适当加糖来维持发酵液中的残糖浓度（90～110g/L），以维持晚上的发酵活动。

1.2.5 分析方法 每天白天早上8:30开膜以后，定时取出上游发酵液和下游渗透液进行分析。对发酵液，先用离心机离心两次，再取出上清液进行蒸馏，用密度仪分别测定乙醇和葡萄糖液的浓度，用全自动生化分析仪精确定量葡萄糖浓度，再将离心后的菌泥洗入培养皿中，放入100℃的烘箱中烘干至恒重，用精度为0.001的电子天平称量干重，对渗透液直接用密度仪进行测量。

2 结果与讨论

2.1 菌种的驯化过程

本文公开的数据，是对自然界中选育的野生酵母菌S3经过3轮的发酵－筛菌－转移培养驯化后，再进行第四轮的500h封闭循环发酵，把第四轮的发酵性能与第一轮的和商用安琪酵母（ADY）的发酵性能进行比较，以研究对S3的驯化效果。

2.1.1 每天的发酵环境变化 在白天（8:30am～7:30pm），渗透汽化膜分离连续取走发酵生成乙醇，并适时加入葡萄糖基质和氨水，操作模式使发酵液中糖浓度、pH和乙醇浓度维持基本恒定。在晚上（7:30pm～8:30am），既无基质加入也无产物取出，纯发酵的过程连续消耗发酵液中的残糖，使糖浓度单调下降，而产物乙醇浓度则单调增加，且发酵液pH也单调下降。这种发酵操作模式使得酵母的生长、繁殖和代谢等活动在一天之中就要经历不同的环境条件变化，通过对发酵性能参数的分析，可以发现酵母细胞的一些适应性驯化行为和特征。

2.1.2 全过程中的发酵环境变化 由于整个500h循环发酵过程中取出的产物只有乙醇，对于酵母菌发酵生成的副产物没有进行任何处理，副产物不断累积使得酵母菌的生存条件不断恶化，通过对全过程的平均发酵性能参数分析，可以发现酵母细胞的一些适应性驯化行为和特征。

2.2 每天适应性的驯化分析

2.2.1 晚上（7:30pm～8:30am）乙醇－细胞比产率比较 图1为野生酵母菌第一轮、第四轮和ADY每天晚上发酵过程中的乙醇－细胞比产率，从图1中的曲线发现，野生酵母在经过3轮发酵驯化后，第四轮在发酵过程中乙醇－细胞比产率与第一轮相比得到显著提高，特别是在5～15d这段时间里，乙醇－细胞比产率提高一倍左右，说明经过本实验系统三轮驯化以后，酵母菌出现适应性进化，发酵能力得到提高。

而与ADY的比较中，我们选用的野生酵母菌在驯化过程中第一轮前期乙醇－细胞比产率就要明显优于ADY，13d以后相互之间差异不再明显，但是第四轮野生酵母菌乙醇－细胞比产率明显高于ADY。但同时可以看出，已经工业化的ADY乙醇－细胞比产率波动明显比我们选育的野生酵母菌小，其菌种的稳定性比较高。说明选育的野生酵母有较高的适应性和进化能力，而ADY菌种经过工业化培养，自身稳定性高，对本系统的适应性差。

图1 晚上（7:30pm～8:30am）乙醇－细胞比产率的时间曲线Fig.1 The time course of ethanol－cells yield from 7:30pm to 8:30am

2.2.2 白天（8:30am～7:30pm）乙醇－细胞比产率和细胞死亡率比较 图2为野生酵母菌第一轮、第四轮和ADY每天白天发酵过程中的乙醇－细胞比产率，图3是发酵过程中的细胞死亡率。从图2中我们可以看出，第1d发酵性能与后面相比出现较大差异，这是由于第1d主要是让酵母菌种在发酵罐中生长。将后面曲线中第四轮白天乙醇－细胞比产率与第一轮相比:第一轮乙醇－细胞比产率表现较平稳，第四轮却出现了明显的波动，特别表现在第4d、第8d和第12d，酵母菌的发酵能力进一步增强，可以看出经过几轮驯化后，酵母菌进化能力得到提高;整体上第四轮比产率明显高于第一轮，可以得出经过3轮驯化后酵母菌出现了适应性进化，发酵能力得到显著提高。ADY和第一轮乙醇－细胞比产率差异整体比较小，与第四轮比较差异较大，乙醇－细胞比产率第四轮明显高于ADY。说明野生酵母对该系统具有更快和更强的适应性。

图2 白天（8:30am～7:30pm）乙醇－细胞比产率的时间曲线Fig.2 The time course of ethanol－cells yield from 8:30am to 7:30pm

在表1中列出了第8d、第9d和第10d的乙醇－细胞比产率、细胞死亡率和乙醇体积产率，单调上升的比产率和体积产率意味着酵母发酵能力的增强，显示了适应性进化的趋势。

表1 菌种适应性行为的比较Table 1 Comparison of the wild yeast adaptive evolution

从图3中可以看出，经过3轮驯化后的野生酵母菌的死亡率与第一轮比较有了减少的趋势，但是与ADY死亡率比较，在前期ADY的死亡率低于我们选育的野生酵母菌，说明我们选育的野生酵母在一定条件下的生存能力还要进一步驯化使其加强，可是在14d以后，ADY的死亡率持续的增加，而野生酵母菌的死亡率达到了一定的稳定状态，这就可以得出选育的野生酵母菌在我们这个发酵系统中，在经过驯化后乙醇－细胞比产率得到提高的同时，其在后期恶劣条件下的生存能力也得到提高，对于长时间的发酵比ADY酵母菌的适应性要好。

图3 细胞死亡率的时间曲线图Fig.3 The time course of cellmortality rate

2.2.3 白天（8:30am～7:30pm）和晚上（7:30pm～8:30am）乙醇－细胞比产率差比较 在对白天和晚上发酵性能的比较中，发现白天的曲线整体比晚上的要平整很多，晚上的波动很大。晚上阶段，系统中没有基质加入，发酵液糖浓度单调下降，膜分离不运行，使发酵液中产物乙醇浓度单调累积增加，且发酵液中的pH未有调整，这些因素使晚上的发酵条件与白天明显不同，酵母菌需要适应不同的环境条件，因此也表现变化的发酵性能﹔而白天阶段，发酵液中的糖浓度、乙醇浓度和pH都由于糖的不断补加、乙醇被膜分离连续提取和酸的加碱中和而保持基本恒定，使得酵母在一个较为稳定的环境中生存，发酵性能表现比较平稳。

2.3 全过程中的驯化分析

在整个循环发酵驯化过程中虽然发酵条件不断恶化，但细胞却能不断保持活性，不断生长。从表2中的数据对比可以看出，第四轮发酵性能与ADY以及第一轮相比较:乙醇－细胞平均比产率、葡萄糖转换率有显著的提高;细胞平均死亡率相比第一轮明显减少，与ADY差异不大;发酵液平均乙醇浓度也不断增高。说明酵母逐渐适应了PDMS膜生物反应器系统的长期封闭循环发酵环境，发酵能力得到改善，或者说产生了一定程度的适应性进化特征;也说明该系统对野生酵母进行驯化的有效性。

表2 乙醇－细胞平均比产率、葡萄糖转化率、细胞平均死亡率、发酵液平均乙醇浓度Table 2 The ethanol－cells yield，glucose conversion ratio，cellmortality ratio，average concentration of ethanol fermentation

3 结论

在PDMS膜生物反应器封闭循环发酵系统中对野生菌种进行驯化，驯化效果很明显。与成熟的工业酵母菌（ADY）相比，在该系统中驯化后的野生酵母菌的发酵能力有很大提高;在发酵过程中，发酵液环境条件变得更加恶劣后，驯化菌株也表现出更好的生长能力和活性，显示出很强的环境适应性。实验证明，用膜生物反应器封闭循环发酵系统来进行菌种的驯化是一种可行的方法。

［1］丁文武，汤晓玉，傅晟伟，等.适合硅橡胶膜生物反应器乙醇发酵的酵母选育［J］.四川大学学报，2011（2）:161－165.

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［3］宋德贵，康浩，杨生玉.高酒精耐受力酵母菌菌种的选育［J］.广西师范大学学报，2008（4）:124－127.

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［5］王昌魁，张利莉，贺江舟，等.耐高温耐高糖酵母的筛选与驯化［J］.江西农业学报，2008（5）:100－101.

［6］宋安东，康怀彬，李艳梅，等.苹果酒酵母菌的驯化实验［J］.酿酒，2003（2）:44－45.

［7］傅晟伟，汤晓玉，周一慧，等.膜生物反应器用于乙醇连续发酵菌株的适应性培养［J］.中国酿造，2010（3）:102－105.

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Acclimatization of w ild yeast through the close－circulating fermentation system w ith a PDMS membrane bioreactor

HU Liang，DING W en－wu，ZHANG Li，WANG Wei，XIAO Ze－yi*
（College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

A w ild yeast strain S3 selec ted from nature was acc lim atized in a PDMS m em b rane b ioreac tor system. After continuous three rounds of c lose－circulating fermentation and acc limatizing cultivation，a fourth round of experim entwas conducted.By com paring ferm ent performances during the first and fourth rounds of experiments，adap tive evolution and acc lim atization of the w ild yeastwere analyzed.The results ind icated that the ethanol yield and g lucose conversion ratio inc reased by 42.9%and 2.1%respectively，and the cellmortality ratio dec reased by 11.04%.Comparing with commercial ADY，the evolved strain of the wild yeast also behaved better fermentation performance.Itwas shown that in the c lose－circulating fermentation system with themembrane bioreactor，the wild yeast could be acc limatized.

PDMSmembrane bioreactor;wild yeast;long－term close－circulating fermentation;acc limatization

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0230－04

2011－06－21 *通讯联系人

胡亮（1986－），男，硕士研究生，主要从事发酵方面的研究。

国家自然科学基金（20776088）。