高效液相色谱法测定五柏参洗液中苦参碱的含量

刘 琼

（湖南安化县人民医院药剂科，湖南 安化 413500）

五柏参洗液由黄柏、苦参、百部、五味子4味中药组成，具有清热、除湿、止痒等功效。用于湿热下注型阴道炎所致带下量多，色黄，味臭。苦参为本制剂的君药，其主要有效成分为苦参碱，苦参碱对大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌及乙型链球菌均有明显的抑制作用， 水煎剂在体外对某些常见的皮肤真菌有不同程度的抑制作用[1]。本文重点研究苦参碱的含量测定方法，为控制该制剂的产品质量和提高其药品标准水平提供依据。

1 材 料

Agilent 1200型HPLC测定仪，包括G1314B紫外检测器、Agilent色谱工作站（美国Agilent科技有限公司）；苦参碱对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号110805－200507）；五柏参洗液（批号111021，120215，120510，批准文号：国药准字B20020613）；阴性样品液为自制；乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱： Agilent XDB-C18（150 mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 6.8，v/v= 20∶75）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：220 nm；进样量：10μL。理论塔板数按苦参碱计算不得低于5×103。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱对照品适量，加甲醇溶解并稀释成苦参碱对照品贮备液（270mg/L），再精密量取该贮备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取本品50 mL，摇匀，精密量取5 mL，加浓氨试液调pH＝10～12后，用氯仿（30、30、30、20、20 mL）提取5次，合并提取液，挥干氯仿，加甲醇适量溶解残渣，滤过，滤渣、容器用甲醇洗涤3次，每次5 mL，合并洗液与滤液，定量转移至100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照样品溶液

按处方比例配制不含苦参的阴性样品，按”2.2.2”项下方法，制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，注入HPLC仪测定，色谱图见图1。结果，供试品色谱中苦参碱与杂质峰分离良好，阴性对照色谱在苦参碱相应位置处无干扰峰，见图1。

图1 高效液相色谱图（A.供试品；B.阴性对照品；C.对照品；1-苦参碱）

2.4 线性关系考察

精密量取对照品1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。分别取10μL，注入HPLC仪测定。以质量浓度（Y）为纵坐标，以峰面积（A）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y= 2.36×10-4A – 1.94（r= 0.9995）。结果表明，苦参碱检测浓度在27.00～135.00 mg/L浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取同一对照品溶液适量，重复进样6次，按照“2.1”项下色谱备件测定。结果，RSD为0.33%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密量取同一对照品溶液适量，按样品含量测定项下操作，隔3h测一次，共测定5次，计算含量。结果，RSD＝0.19%，说明供试品在16h内稳定。

2.7 重复性试验

取含量测定项下的供试品溶液（批号：201205102）适量，重复测定6次。结果，RSD＝0.39%，说明重复性良好。

2.8 回收试验

采取加样回收法。精密吸取已知含量的样品（批号201205102，0.84 g/L）2.5mL，至蒸发皿中，精密加入苦参碱对照品贮备液7，8，9 mL（即加入1.89，2.16，2.43 mg），照“2.2.2 ”项下方法制备供试液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=9）

2.9 样品含量测定

取3批五柏参洗液（批号201110212，201202151，201205102）按”2.2.2” 项下方法提取及“2.1”项的色谱条件测定，以峰面积代入回归方程中计算苦参碱含量。结果见表2。

表2 五柏参洗液中苦参碱含量测定结果

3 讨 论

3.1 检测方法的确定

苦参碱的含量测定有容量法、薄层扫描法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法等，笔者参考苦参碱含量测定的相关报道[2-5]，采用HPLC 法测定本制剂中苦参碱的含量。

3.2 检测波长的选择

经对比不同检测波长下色谱峰的强度和分离度，确认苦参碱在220nm检测波长下有最大吸收，且干扰峰少，据此本实验中选择220nm作为测定苦参碱的检测波长。

3.3 流动相的选择

本实验在流动相选择上曾使用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（1∶9）、乙腈-0.005 mol/L庚烷基磺酸钠溶液（25∶75）、乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 6.8，v/v= 20∶75）。经多次测试结果表明，采用乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 6.8，v/v= 20∶75），可以有效改善苦参碱峰形，抑制峰拖尾，理论塔板数均符合相关要求。因此，选择乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相。

3.4 萃取次数和PH的考察

取五柏参洗液5 mL，加浓氨试液调pH＝10后，分别用氯仿（30、30、30、20、20、20 mL）提取3、4、5、6次，合并提取液，挥干氯仿，加甲醇适量溶解残渣，滤过，滤渣，容器用甲醇洗涤3次，每次5 mL，合并洗液与滤液，定量转移至100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，通过比较峰面积，5次萃取基本可将苦参碱萃取完全。萃取苦参碱时，调节溶液pH＜9，则测定结果偏差较大，这可能与苦参碱的化学性质有关[6]，因此操作上应加以注意。

综上所述，本方法准确、灵敏度高、重复性好，可用于五柏参洗液的质量控制。

[1]高学敏.中药学[M].北京:中国中医药出版社,2007:103.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:141-582.

[3]夏学励.HPLC法测定癣净颗粒中苦参碱、氧化苦参碱的含量[J].中国药房,2009,20(18):1420.

[4]叶秀金,宋粉云.HPLC法测定清肺抑火丸中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中国药房,2011,22(12):1127.

[5]佘志华,文晓柯,吴雅丽.高效液相色谱法测定阴炎净中苦参碱的含量[J].中南药学,2008,6(5):559.

[6]崔鹦,张懿,胡春梅.苦参生物碱的提取与分离[J].重庆工学院学报(自然科学版),2007,21(3):113-116.