重组人血管内皮抑制素促进肺癌细胞共培养体系中血管内皮细胞的凋亡机制研究

陈小平 张 茜

（连云港市第二人民医院，江苏 连云港 222023）

重组人血管内皮抑制素注射液(Endostar, 恩度)是一种新型的多靶点的血管内皮生长抑制剂，能有效的抑制肿瘤血管的生成，临床用于多种肿瘤的治疗[1]。研究显示，恩度能特异性的作用于肿瘤微血管内皮细胞，抑制血管生成，抑制肿瘤的生长、侵袭、迁移。随着环境污染的加重(如PM2.5、PM10.0)、吸烟等因素的影响[2]。肺癌已占据肿瘤患者的发生率和病死率的首位。在临床治疗中，恩度常用于肺癌的治疗。目前文献报道多集中对恩度调控血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素1、2(Ang1、2)、成纤维细胞生长因子(FGF)等表达的影响[3]。但对血管内皮细胞凋亡的研究较少。因此，在本研究中，将建立非小细胞肺癌细胞A549细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外共培养体系，探讨恩度对内皮细胞凋亡的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌A549细胞株、人脐静脉内皮细胞HUVECs(中国科学院上海细胞库)；超净工作台 (ESCO公司，新加坡)；二氧化碳培养箱(长沙长锦科技有限公司，湖南)；RPMI1640和DMEM培养基(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司，批号：110213)、重组人血管内皮抑制素 (恩度): 烟台麦得津生物工程有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)(美国,Sigma公司)；Transwll迁移小室(直径6mm，孔径5μm，Corning)；Bax，Bcl-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇(TNP-470，日本Osaka Takeda公司产品)。AnnexinV2FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)。链霉亲和生物素酶复合物(SABC)试剂盒购自武汉博士得。酶联分析仪为SPECTRAmax190 (Moleculor Devices, USA)；荧光显微镜 (Olympus IX71倒置荧光显微镜奥林巴斯BX51，日本)。其余试剂为商业来源的分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞和HUVECs细胞共培养体系的建立

取对数生长期的A549和HUVECs细胞，分别以0.25%胰酶-0.01%EDTA消化，加入RPMI-1640培养基分别制备成2×104细胞/mL的A549单细胞悬液和1×105细胞/mL的HUVECs单细胞悬液，将6孔板Transwell 小室的下室接种上HUVECs，上室接种上A549细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基 (100 U/mL青霉素和 100 U/mL链霉素培养)，以保证上室的细胞培养在培养基中。将Transwell板置于37℃ 5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 恩度共培养体系中对HUVECs生长抑制作用

待下室HUVECs长至75%～85%融合度时，将细胞以含药培养基处理。恩度的浓度分别为10、20、40、80、100μg/mL，空白对照组加100μL培养基代替，阳性对照组以TNP-470(终浓度25μg/mL)，另设本底对照孔(等体积含相应浓度药物的无细胞培养液)，每组设3个平行孔。待孵育48h后，弃去每孔的含药血清，重新加入1mL不含血清的培养基，另加入MTT液(5 mg/mL)20μL，培养箱中孵育4h，弃去液体，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL，于震荡器中振荡10min，酶联免疫检测仪580nm波长测定OD值。生长抑制率按以下公式计算。实验重复3次。

细胞生长抑制率=(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值×100%

1.2.3 流式细胞术测定HUVECs凋亡

按1.2.2项下接种细胞，并给予药物。药物处理并培养48h后，根据下述步骤采用Annexin V-FITC试剂盒测定细胞凋亡：将下室HUVECs细胞以胰酶-EDTA消化，收集细胞，以培养基终止消化。每个样本至少计数1×104细胞。将收集的细胞以冷的 PBS润洗2遍，以500μL结合缓冲液悬浮细胞，加入5μLAnnexin V- FITC，轻微混匀；测定前加入5μLPI并置于暗处避光反应15min。上机测定。每组平行2个样本。

1.2.4 免疫细胞化学检测恩度对HUVECs中Bcl-2和Bax凋亡蛋白的影响

以链霉亲和生物素酶复合物(SABC)方法评价恩度对共培养体系中HUVECs的Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。HUVECs接种在玻片上。恩度的浓度为10、20和40μg/mL。其他细胞接种和给药同1.2.2项下操作。待培养48 h后，细胞用PBS洗3次，每次1min；4%多聚甲醛室温下固定90min，PBS 清洗标本 3次，每次2 min；0.5% Triton X-100孵育20min，PBS洗涤3次，每次2min；以H2O2处理30min；PBS 洗涤3次，每次2min；然后以10%封闭血清孵育37℃20min。加入Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶200)抗体37 ℃下孵育；120min后，加入二抗，孵育20min；PBS洗涤，以SABC溶液处理样本。最后，以3，3'-二氨基联苯胺(DAB，0.3mg/mL)处理，镜下控制反应时间，苏木素轻度复染，PBS洗涤，中性树胶封片。镜下Image-ProPlus图像分析软件拍片。阴性对照组以PBS替代一抗。

1.2.5 Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白

细胞接种和给药同1.2.4项下操作。以胰酶-EDTA消化并收集细胞，加入冰冷PBS润洗3次，然后加入400μL 裂解液，置于冰上裂解细胞30min。于4℃离心机中14000rpm 离心5min，提取上清液，测定蛋白质浓度后，进行SDS-PAGE转膜。以含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST室温下封闭1h，加入Bcl-2与Bax抗体，4℃摇床过夜。加入HRPIgG 二抗(1∶1000)杂交，洗膜后显色。置于凝胶成像系统中分析Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件统计分析。所有数据均以均数±标准差(±s)。以One-way ANOVA方差分析对各组数据进行组间差异比较。P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 恩度抑制内皮细胞增殖

恩度对HUVECs生长抑制率随着浓度的升高逐渐升高，10μg/mL恩度的生长抑制率为(8.19±2.04)%，100μg/mL恩度的生长抑制率为(65.13±3.78)%。阳性对照25μg/mLTNP-470对HUVECs的生长抑制率为37.56±7.22%(表1)。结果表明，恩度具有较强的抑制HUVECs细胞增殖活性。

表1 恩度对HUVECs增殖抑制作用

2.2 恩度诱导内皮细胞凋亡

恩度处理48h后，10、20、40、80、100μg/mL浓度的恩度的凋亡率分别为(5.29±1.21)%、(8.33±0.62)%、(14.81 ±0.77)%、(21.87±0.96)%、(26.15±1.06)%(表2)。研究结果表明，在A549与HUVECs共培养体系中，恩度对HUVECs 细胞具有诱导凋亡作用。

表2 恩度诱导HUVECs细胞凋亡率 (n=3)

2.3 免疫细胞化学测定恩度调节凋亡蛋白表达

在给予10、20、40 μg/mL 恩度48h后，促凋亡蛋白Bad蛋白表达分别为（5.57±1.74）%、（6.26±2.34）%和（8.16±1.58）%；抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达分别为（12.33±2.18）%、（8.67±1.55）%和（6.39±2.14）%(表3)。结果表明，在共培养体系中，恩度上调促凋亡蛋白Bax的表达，而降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。

表3 恩度对HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 (n=3)

2.4 凋亡蛋白的Western blotting测定

Western blotting检测结果表明，10、20、40μg/mL恩度对抑凋亡蛋白Bcl-2相对表达量分别为（0.46±0.06）%、（0.34±0.07）%、（0.27±0.05）%；对促凋亡蛋白Bax相对表达量分别为（0.25±0.09）%、（0.36±0.12）%、（0.48±0.11）%(表4)。实验组与空白组相比有统计学差异(P＜0.05)。

表4 Western blotting测定恩度对HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 (n=3)

3 讨 论

据世界卫生组织统计数据显示，随着环境污染的逐渐严重以及吸烟等因素的影响，肺癌的发生率和病死率已经占据肿瘤的首位，严重威胁人类健康和生存质量。在临床中，肺癌常发生转移引发其他肿瘤。而在肺癌的发展与转移等生物学行为都依赖新血管的生成。研究显示，当瘤块及其转移灶生长至1～2mm以上时，需要进一步生长和转移，需要新生毛细血管提供氧和营养[4]。因此，通过抑制肺癌的血管生成成为抑制肺癌转移、抑制癌组织生长的有效措施。

近些年来，被称为“肿瘤饥饿疗法”的抗肿瘤血管生成成为抑制肺癌瘤块生长、转移的有效途径。恩度是国内首例重组人血管内皮抑制素，是通过抑制血管内皮细胞迁移来抑制肿瘤新生血管形成。目前，研究最多的是抑制血管内皮的生长因子如VEGF等的表达以及抑制内皮细胞的迁移。众多研究表明，诱导内皮细胞凋亡也是抑制血管生成的一个重要机制[5，6]。在本研究中，建立人非小细胞肺癌A549细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养体系，探讨恩度诱导HUVECs凋亡的作用及机制。本研究的结果显示，在共培养体系中，恩度能显著抑制HUVECs的增殖，并促进HUVECs的凋亡。

Bcl-2家族蛋白在血管内皮的凋亡中扮演着重要的作用。Bcl-2家族包括抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bad等。在正常细胞内，抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白体系处于相对平衡状态；但当在处于因素的刺激下，这种平衡被打破，抑凋亡处于下调状态，而促凋亡蛋白处于上升状态[6]。本研究显示，当给予血管内皮抑制剂恩度48h后，抑凋亡蛋白Bcl-2被显著下调，而促凋亡蛋白Bax被显著上调。结果表明，在共培养体系中，恩度能通过调节凋亡因子促进血管内皮凋亡而抑制血管内皮的生长。

总之，我们的研究探讨了恩度抑制血管内皮生长的凋亡机制。这为恩度在临床上的进一步使用提供实验依据。

[1]李忠义,刘江秋,徐璐,等.重组人血管内皮抑制素对小鼠Lewis肺癌肿瘤抑制作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(4): 274-276.

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[3]殷宗宝,王洪武,邓超,等.重组人血管内皮抑制素注射液对低O2高CO2肺动脉高压大鼠IL-6,eNOS,VEGF 的影响[J].实用医学杂志,2010,26(18): 3311-3313.

[4]Folkman J.Tumor angiogenesis: therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[5]许成云,倪庆桂,樊馨,等.重组人血管内皮抑制素对肺微血管内皮细胞增殖及其周期分布的影响[J].临床肿瘤学杂志,2009,14(5):410-413.

[6]Feng L,Xu YH,Wang SS,Au-Yeung W,et al.Preventative Effects of 4,4'-Diphenylmethane-bis(methyl)Carbamate Isolated from Cortex Mori on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Dysfunction Induced by Advanced Glycation End Products[J].Phytother Res,2012,26(3):412-419.