鳄鱼肉提取物增强免疫力的实验研究

2012-11-15汤四荣周靖宇吴松青

中国医药指南 2012年30期

汤四荣周靖宇吴松青

（广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司，广东广州 510330）

鳄鱼，属脊椎类两栖爬行动物，我国古代称为鼍龙”，是一种科研价值、生态价值、经济价值较高的野生动物。其药用价值始载于《名医别录》：“主少气吸吸，足不立地。”“少气吸吸” 即指今天的咳嗽、哮喘。近十年来，随着科技含量的提高，鳄鱼的药用价值得到了越来越广泛的认识。现代医学认为，鳄鱼肉、骨、甲及内脏含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和多种微量元素，能补气、壮筋骨、驱湿邪，治哮喘，食用有提高免疫力的功效，其营养价值比猪、牛、羊肉都高。有关鳄鱼肉相关提取物的研究偶有报道，提示鳄鱼肉可能有增强免疫力的功效。通过本实验，检验人工养殖暹罗鳄鱼肉酶解液的增强免疫力的效果，对鳄鱼肉的相关研究提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料

受试样品：鳄鱼肉酶解液（简称EM），200g新鲜鳄鱼肉通过蛋白酶酶解后，制成300mL鳄鱼肉酶解液，自制；环磷酰胺注射粉针，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。KM小鼠，SPF级，体质量18～22g，购于广东省医学实验动物中心。鳄鱼肉酶解液按照人体用量3.6mL/天，按5倍、10倍、30倍三组剂量喂养小鼠。折算后低、中、高剂量分别为0.3mL/kg、0.6mL/kg、1.8mL/kg。每组10只小鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 迟发性变态反应实验

各组小鼠先灌胃给药5周，正常组、未致敏组和环磷酰胺模型组小鼠灌胃给予纯净水，给药第4周开始，除正常组和未致敏组外，其它各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，每周1次连续2周造模。喂养结束后，除未致敏组外，其余组用1%DNCB丙酮麻油（丙酮：麻油=1∶1）50μL涂沫在小鼠腹部（皮毛预先减去），第2天强化一次，5日后，用1%DNCB丙酮麻油10uL涂沫小鼠右耳，24h后处死，打孔器打下8mm耳片，称重，计算左右耳片重量之差，表示DTH程度。

1.2.2 血清溶血素实验

各组小鼠连续给药2周，正常组给予纯净水。第10天腹腔注射2%SRBC悬液0.2mL，5天后摘眼取血，分离血清，稀释100倍后进行溶血素测定。取稀释的血清1mL，加入0.5mL 10% SRBC悬液、1mL 1∶8稀释的豚鼠血清，对照管取1mL生理盐水，加入0.5mL 10%SRBC悬液，1mL 1∶8稀释的豚鼠血清，37℃恒温水浴10min，冰水终止反应，2000rpm/min离心10min，取1mL上清液，加入3mL都氏试剂，同时取10%（v/v）SRBC 0.25mL 加都氏试剂至4mL，混匀，静置10min后，以对照管作为试剂空白，于540nm波长处比色，测定OD值。另取0.25mL 10% SRBC悬液，用都氏试剂稀释至4mL,，摇匀放置10min后，于540nm测定SRBC半数溶血时的OD值。按下式计算样品的半数溶血值（HC50）。

1.2.3 小鼠碳廓清实验

实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，连续给药4周，正常对照组和模型对照组小鼠灌胃给予同体积的纯净水。同时用注射用环磷酰胺150mg/kg造成小鼠的免疫抑制模型，除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺剂量为150mg/kg，每周1次。于末次给药30min后，尾静脉注射已用生理盐水稀释10倍并经过滤的中华墨汁0.2mL/20g，注射后2min及15min时，用预先1%肝素钠湿润的吸管分别从眶后静脉丛取血20μL溶于2mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，在波长A640nm下比色，测定光密度OD值。实验结束后处死小鼠，分别称取肝、脾、胸腺重量。按公式计算廓清指数K或校正系数α值。

注：OD1，OD2:不同时间所取血样的光密度；t2-t1:两取血样的时间差。

1.2.4 对小鼠NK细胞的影响

小鼠每日灌胃给药1次，连续给药8周，给药第5周开始，采用外周血NK计数。摘眼采血0.5mL于EDTA-K2抗凝管内混匀，取50μL外周血于流式管，另取50μL外周血加于阴性流式管，设定NK1.1抗体单染管及CD3抗体单染管。各组小鼠外周血加入NK1.1抗体2.5μL及CD3抗体2μL，避光反应15min，加入溶血素1mL，避光反应10min，1000rpm/min离心5min，弃上清，用2mL PBS洗涤1次，振荡，1000rpm/min离心5min，弃上清；0.5mL PBS重悬，上机。