创伤后应激障碍大鼠海马分子伴侣葡萄糖调节蛋白94表达的变化

谢菊华，韩芳，石玉秀

（中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳 1 1 0 0 0 1）

创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指经历了巨大生命威胁或对身心有严重损害事件后发生的一系列精神心理综合征［1］，目前发病机制尚不清楚。葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein，GRP）94属于热休克蛋白90家族，是常见的内质网分子伴侣，在钙稳态维持，蛋白质合成、降解，启动内质网应激—未折叠蛋白反应以及内质网径路细胞凋亡上具有重要作用［2，3］。本研究拟采用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR方法检测PTSD大鼠海马神经元GRP94的表达变化，旨在为进一步探讨内质网应激、内质网径路细胞凋亡在PTSD发病机制中的作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组：健康成年雄性Wistar大鼠45只（中国医科大学实验动物中心提供），体质量150~220 g，平均（180±20）g。常规喂养 7 d 后，随机分为正常对照（nd）组、SPS模型 7 d（sps-7d）组、SPS模型 14 d（sps-14d）组，每组各 15 只。

1.1.2 单一延长应激（single-prolonged stress，SPS）模型制备［4］：将大鼠头朝瓶嘴固定于塑料瓶中，尾巴暴露在外，胶带捆紧，水平放置禁锢2 h。拆除塑料瓶，直接将大鼠投入水深 30 cm、水温（24±2）℃的矩形水槽中，计时20 min。让大鼠休息15 min后，置入乙醚缸内麻醉至意识丧失。随后将大鼠放回笼中，常规饲养至取材。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化：每组各取大鼠5只，常规0.4%戊巴比妥腹腔麻醉后暴露心脏，于左心室插管，并剪开右心耳，用37℃预热的0.9%氯化钠溶液灌流冲洗血道至流出液无色。随后用4%多聚甲醛灌流固定至大鼠四肢僵直、肝脏发硬。取出大鼠脑组织，4%多聚甲醛后固定至少12 h。常规脱水、石蜡包埋、切片待用（厚度 7 μm）。60℃烤片 2 h；脱蜡、梯度乙醇；用30%过氧化氢（1份）+蒸馏水（10份）去除内源性过氧化物酶；0.3%Triton洗10 min；枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液高压热修复2.5 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；滴加5%BSA，20 min后分别滴加兔来源多克隆GRP94一抗（Santa Cruz Biotechnology，美国，1︰200稀释），4℃过夜；0.01 mol/L PBS液漂洗 5 min×3次后滴加二抗（武汉博士德SABC试剂盒），37℃恒温箱中孵育30 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次后滴加HRP标记的SABC孵育20 min，洗涤，DAB显色，脱水、透明、封片，于光学显微镜（OLYMPUS，BX60，日本）下观察并照相。以 Meta－Morph/DPIO/BX41形态学图象分析系统软件进行图像积分光密度（integral optical density，IOD）半定量分析。

1.2.2 Western blot：每组取5只大鼠，快速断头，冰上取海马。匀浆、超声粉碎后，于4℃下12 000 r/min离心30 min，取上清，-20℃保存备用。根据Bradford法检测蛋白浓度，取50 μg样品蛋白于12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，湿法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉常温摇床封闭2 h。加入一抗（GRP94一抗：Santa Cruz Biotechnology，美国，兔来源多克隆抗体，1︰200稀释；GAPDH一抗：北京中杉金桥公司，兔来源多克隆抗体，1︰500稀释）4℃过夜；常温下复温30 min后，TBST洗15 min×3次，HRP标记的二抗（均为北京中杉金桥，羊抗兔，1︰2 000）常温下孵育2 h；TBST洗15 min×3次，ECL显色，图像分析。采用Image J分析软件进行蛋白水平半定量分析。每组独立实验重复至少3次，取平均值。目的条带与内参照蛋白GAPDH平均灰度值比值即GRP94/GAPDH蛋白水平。

1.2.3 RT-PCR：每组取5只大鼠，冰上直接断头取海马组织。按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，测定浓度和纯度，依据RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，美国）逆转录为cDNA。根据Prime 5.0软件设计出GRP94引物序列：上游5′-GACGGGCAAGGACATT ACAAA-3′，下游 5′-CTTCTTCTTCTGCCCCTGCGTC TG-3′，扩增片段长度362 bp，退火温度为56℃，循环次数30次。内参照β-actin引物序列：上游5′-ATCACCCACACTGTGCCCATC-3， 下 游 5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′，扩增片段长度542 bp，退火温度为58℃，循环次数30次。取PCR产物5 μL行2.0%琼脂糖凝胶电泳，用天能2500R凝胶成像分析仪进行成像、数据分析。mRNA相对定量为PCR产物扫描值与β-actin扫描值的比值。1.3 统计学分析

采用SPSS11.5软件进行统计分析。定量资料用x±s表示，组间采取单因素方差分析。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化结果

GRP94免疫组化阳性产物主要表达于神经元核周质中，为棕黄色。nd组、sps-7d组和sps-14d组免疫组化结果如图1所示：SPS模型大鼠GRP94蛋白的表达在建模后第7天有明显升高（IOD：11.63±1.77，P<0.05），；第 14天时表达降低（IOD：6.96±1.89，P<0.05），但仍较正常 IOD 水平（6.05±1.85）稍高。

2.2 Western blot结果

GRP94蛋白分子量约为94 kDa，GAPDH蛋白分子量约为36 kDa。建立SPS模型后第7天，GRP94相对表达量（0.59±0.03）明显高于正常对照组（0.27±0.03）（P<0.05）；建模后第 14 天，GRP94相对表达量（0.41±0.02）明显低于第 7天（P<0.05）。见图2。

2.3 RT-PCR结果

RT-PCR结果显示：sps-7d组GRP94mRNA相对表达量（0.88±0.07）较 nd组（0.32±0.04）明显升高（P<0.05，图 3），sps-14d 组相对表达量（0.44±0.09）较sps-7d组明显降低（P<0.05），但未恢复nd组水平。

3 讨论

随着国内外自然灾害、恐怖袭击等重大突发事件的增加，PTSD发病率显著上升。据流行病学研究调查发现，我国汶川地震损害严重的地区PTSD发生率高达45.5%，已远远超过伊拉克战争中战士PTSD的发生率（12.2%）［5］。PTSD已成为关系社会公众健康的重要的公共卫生问题［6］，因此，PTSD发病机制的研究备受国内外关注。

目前许多临床影像学研究发现PTSD发病与海马体积缩小有关，PTSD发病可能是海马神经元遭遇巨大损害后自身修复障碍并最终引起细胞凋亡所致［7~9］。鉴于PTSD发病与巨大应激源刺激相关，而内质网对细胞内外环境变化最为敏感，我们推测引发PTSD的巨大应激源可能通过触发内质网应激机制、激活未折叠蛋白反应，导致内质网自稳功能失调，最终可能启动了内质网径路细胞凋亡而致海马神经元死亡、海马体积缩小。GRP94是常见的内质网分子伴侣之一，属于热休克蛋白90家族。GRP94在蛋白质合成、分泌的信号转导及抑制钙离子耗竭中起重要作用［10］，它通过感受内质网应激激活信号，激活内质网未折叠蛋白反应、结合错误折叠蛋白及未折叠蛋白，用以应对内质网应激、协助蛋白质的正确折叠，同时，GRP94在内质网应激所致细胞死亡中也发挥了一定的抗凋亡作用［11，12］。

本研究结果发现：经禁锢、强迫游泳、乙醚麻醉后常规喂养7 d的Wistar大鼠海马锥体细胞中GRP94蛋白阳性表达量较正常对照组明显增加（P<0.05）；sps-7d组大鼠海马GRP94mRNA表达量相对增多（P<0.05），提示PTSD大鼠海马神经元确实发生了GRP94的表达改变，这种改变可能与海马神经元启动内质网应激机制，内质网分子伴侣GRP94转录与翻译水平均反应性增加有关。而SPS14 d后GRP94蛋白表达水平显著降低（P<0.05），mRNA表达也相对减少（P<0.05），但仍稍高于正常水平，这可能与海马神经元无法通过内质网应激恢复细胞损伤，神经元功能受损，蛋白质合成减少及细胞自稳调节机制异常有关。同时也说明GRP94可能参与了PTSD大鼠海马神经元内质网应激后的功能自我修复，可能是SPS刺激后海马神经元功能难以修复后引发内质网径路细胞凋亡、海马体积缩小的重要分子机制。

［1］Vieweg WV，Julius DA，Fernandez A，et al.Posttraumatic stress disorder：clinicalfeatures，pathophysiology，andtreatment［J］.AmJMed，2006，119（15）：383-390.

［2］Gidalevitz T，Biswas C，Ding H，et al.Identification of the N-terminal peptidebindingsiteofglucose-regulatedprotein94［J］.J Biol Chem，2004，279（16）：16543-16552.

［3］Biswas C，Sriram U，Ciric B，et al.The N-terminal fragment of GRP94 is sufficient for peptide presen-tation via professional APCs［J］.Int Immunol，2006，18（7）：1147-1157.

［4］丁金兰，韩芳，石玉秀.PTSD大鼠杏仁核IJTP及乙酰胆碱酯酶表达的变化［J］.解剖科学进展，2009，15（2）：212-215．

［5］Hoge CW，Castro CA，Messer SC，et al.Combat duty in Iraq and Afghanistan，mental health problems，and barriers to care［J］.N Engl J Med，，2004，351（1）：13-22．

［6］Thaddeus WW，Christine MH.A short review on the psychoneuroimmunology of posttraumatic stress disorder：From risk factors to medical comorbidities［J］.Brain Behav Immun，2011，25（1）：6-13．

［7］Bonne O，Vythilingam M，Inagaki M，et al.Reduced posterior hippocampal volume in posttraumatic stress disorder［J］.J Clin Psychiatry，2008，69（7）：1087-1091.

［8］Kitayama N，Vaccarino V，Kutner M，et al.Magnetic resonance imaging（MRI）measurement of hippocampal volume in posttraumatic stress disorder：a meta-analysis［J］.J Affect Disord，2005，88（1）：79-86.

［9］Vythilingam M，Luckenbaugh DA，Lam T，et al.Smaller head of the hippocampus in Gulf War-related posttraumatic stress disorder［J］.Psychiatry Res，2005，139（2）：89-99.

［10］Bando Y，Katayama T，Kasai K，et al.GRP94（94 kDa glucose-regulated protein）suppresses ischemic neuronal cell death against ischemia/reperfusion injur y［J］.Eur J Neurosci，2003，18（4）：829-840.

［11］Reddy RK，Lu J，Lee AS.The endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 with Ca2-binding and antiapoptotic properties is a novel proteolytic target of calpain during etoposide-induced apoptosis［J］.J Biol Chem，1999，274（40）：28476-28483.

［12］Lee SH，Song R，Lee MN，et al.A molecular chaperone glucose-regulated protein 94 blocks apoptosis induced by virus infection［J］.Hepatology，2008，47（3）：855-866.