健脾养血祛风法对小鼠皮肤屏障功能影响的实验研究

叶建州， 杨雪松，李 钦

（1.云南省中医医院，云南 昆明650021；2.云南省中医中药研究院，云南 昆明650223）

角质层是皮肤表皮的最外层，能直接体现出皮肤的外观和健康状况，并在保障皮肤正常的屏障功能上起重要作用。神经酰胺（ceramide）是一种类磷脂，它占角质层脂质中40%～50%比重，是角质层的主要成分，它在保持角质层水分平衡，维护皮肤屏障功能起到极其重要的作用，相当于角质细胞砖之间泥浆的主要成分，表皮层除去神经酰胺就能使皮肤屏障功能几近丧失。

特应性皮炎（atopic der matitis，AD）患者不仅病变部位皮肤神经酰胺的含量明显减少，并且正常皮肤处神经酰胺的含量也较正常人低，经表皮丧失水分也叫正常人多，常伴有皮肤干燥症［1～2］。皮肤神经酰胺含量的减少是特应性皮炎患者皮肤屏障功能低下的指标。瘙痒是特应性皮炎的一个重要特征［3］。

本实验通过复制大黄所致脾虚动物模型并进一步复制瘙痒（血燥）模型，通过程度其表皮神经酰胺含量这一皮肤屏障功能的重要指标，瘙痒行为及表皮厚度，探讨健脾养血祛风法对皮肤机械屏障功能的影响，探索特应性皮炎中医治疗规律及机制。

1 实验基础条件测定、仪器及材料

1.1 小鼠表皮脂质的抽提及表皮中神经酰胺含量测定

1.1.1 取材 选用ICR小鼠，将小鼠处死，剪毛，取下剪毛后的皮肤，用直径为8 mm的打耳器经剪下的皮肤打成0.5 c m2大小的皮肤圆片，每只鼠打6个圆片作为一份皮肤样品，总面积为3 c m2

1.1.2 实验仪器 BIO－RAD Gel Doc凝胶成像系统，匀浆机FLUKO F6／10，高速离心机 北京京立离心机有限公司LG10－2.4 A，低温冰箱 日本产SANYO MDF－U33，电子天平上海普利塞斯有限公司XS125A。

1.1.3 药品与试剂 神经酰胺标准品和朊酶：美国西格玛公司，氮气（昆明氧气厂），磷酸盐缓冲液（PBS液），正乙烷，乙酸乙酯，氯仿，甲醇氨水，硫酸铜，磷酸，醋酸 产自国药集团化学试剂有限公司（均为分析纯）；其他材料：定量毛细管，薄层色谱硅胶板，定量滤纸，薄层色铺展开缸，耳肿打耳器，移液器。

1.1.4 表皮中神经酰胺含量测定 将所取皮肤浸泡于朊酶液中，放置过夜，分离表皮，按Blight＆Dyer法［4］抽提表皮脂质，－40℃保存。

1.1.4.1 对照品溶液的制备 精密称取神经酰胺对照品0.0052 g，置5 mL容量瓶中，加氯仿适量，振摇使溶解，加氯仿稀释至刻度，摇匀。从中精密吸取1 mL溶液，置5 mL容量瓶中加氯仿适量，振摇使溶解，加氯仿稀释至刻度，摇匀。即得0.208 mg／mL对照品溶液。用0.10 mL氯仿溶解所抽提出的脂质，即得供试品溶液。

1.1.4.2 供试品溶液的制备 用0.10 mL氯仿溶解所抽提的脂质，即得供试品溶液。

1.1.4.3 薄层色谱条件 薄层板：北京颇赛科技公司Silca gel 60，点样：点样基线距底边1 c m，将样品点于基线上。展开：薄层板于氯仿：甲醇：水（80∶20∶1）中上行展开，取出晾干。显色：硫酸铜磷酸溶液显色，与140℃下烘至显色。

1.1.4.4 含量测定方法 显色后的薄层板用BIO－RAD Gel Doc凝胶成像系统采集图像，Quantity One软件分析，进行含量测定。

1.1.4.5 方法学考察 工作曲线的绘制：精密吸取对照品溶液2、4、6、8、101分别点于统一薄层板上，按上述薄层色谱条件展开、显色、采集图像、分析定量。经神经酰胺线性关系考察后，利用回归方程计算相关系数，表明神经酰胺在0.416～2.08μg范围内，含量与密度积分值线性关系良好。

1.2 瘙痒测定方法［5］

1.2.1 造模方法 于造模前1 d，剪掉颈背部毛，用4 c m2脱脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液（1：1）覆盖于剪毛处15 s，而后取另一4 c m2脱脂棉蘸取蒸馏水覆盖于剪毛处30 s，2次／d，2次时间间隔至少为6 h。

1.2.2 瘙痒行为［5］于第14 d观察各组动物瘙痒行为，在BI－2000医学图像分析仪系统下录像2小时10秒，前10 min为适应期，录像结束后观察并记录后2 h内各组动物的以后足搔抓造模部位的次数。

2 方法与结果

2.1 实验方法及药物制备 将70只体重在18～25 g的ICR小鼠随机分为7组，清洁级，雌雄各半，每组10只（由四川省医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（川））。分为空白组，大黄模型组，治疗高剂量组，治疗低剂量组，预防模型组，预防高剂量组，预防低剂量组。大黄浓缩液：以大黄水煎、过滤、合并滤液、浓缩制成浸膏，以蒸馏水稀释为200%药液，4℃保存。健脾养血祛风方：按方中比例水煎、过滤、合并滤液、浓缩制成浸膏，以蒸馏水稀释为120%药液，4℃保存。

2.2 造模方法 对照组给予等量蒸馏水。模型组：大黄组［6］，灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／d，连续8 d，造成泻下脾虚模型。治疗高剂量组：灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／d，连续8 d，造成泻下脾虚模型，第9 d同时开始给予瘙痒2次／d，2次间隔大于6 h，连续5 d，共13 d。第11 d时灌胃24.375 g生药／kg健脾养血祛风方浓缩液，1次／d。治疗低剂量组：灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／d，连续8 d，造成泻下脾虚模型，第9 d同时开始给予瘙痒2次／d，两次间隔大于6 h，连续5 d，共13 d。第11 d时灌胃8.125 g生药／kg健脾养血祛风方浓缩液，1次／d。预防模型组：灌胃蒸馏水5 d后，第6 d灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／d，连续8 d，造成泻下脾虚模型，第9 d同时开始给予瘙痒2次／日，2次间隔大于6 h，连续5 d，共13 d。预防高剂量组：灌胃24.375 g生药／kg健脾养血祛风方（组成：黄芪30 g，白术15 g，当归15 g，制首乌30 g，防风20 g，刺蒺藜30 g，蜈蚣15 g）浓缩液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／日，连续8 d，第9 d同时开始予瘙痒2次／d，2次间隔大于6 h，连续5 d，共13 d。

预防低剂量组：灌胃8.125 g生药／kg健脾养血祛风方浓缩液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃给予200%大黄水煎液，0.5 mL／只，1次／日，连续8 d，第9 d同时开始予瘙痒2次／日，2次间隔大于6 h，连续5 d，共13 d。

2.3 观察指标

2.3.1 一般行为［7］观察各组动物的行为状态，注意观察大黄组动物是否出现精神倦怠，嗜卧，懒动，拱背，扎堆，眼眯，毛色枯黄，甚至稀少，耳，尾色白，软便，便溏，泄泻，体重增长减慢或体重下降，食量减少等脾虚症状。出现5个以上即可认为脾虚模型复制成功。

2.3.2 表皮神经酰胺测定 按“小鼠表皮脂质的抽提及表皮中神经酰胺含量测定方法研究”中方法取皮，抽提出表皮脂质并测定其中神经酰胺的含量。

2.3.3 瘙痒行为 按上文“瘙痒方法”统计各组小鼠瘙痒次数并比较各组间差异。

2.4 统计方法 神经酰胺，瘙痒次数和表皮厚度统计方法：用多个样本均数间两两比较，q检验的方法，（Newmankueuls法）。

2.5 实验结果 大黄组动物灌胃给予大黄，大黄治疗模型组：2天后出现便软，稀便，第4天出现腹泻，稀水便，懒动，扎堆，毛憔悴。体重增长减慢，进食量减少。空白组动物无异常情况，体重增加迅速，进食量增加。

表2 瘙痒次数测定结果

表3 各组动物剪毛造模部位表皮厚度测量结果

3 讨论

特应性皮炎是中医学“浸淫疮”，“奶癣”及“四弯风”范畴。多因“先天禀性不耐，脾失健运，水湿停滞，化热内生，浸淫肌肤“而发病。脾失统导致在疾病早期津液大量外渗，渗液日久不仅使脉中之津液不足，脉络空虚，因虚而致风，血虚风燥，肤失所养而迁延不愈。其病理基础是以虚为本，以风湿热邪为标。主要表现为脾虚湿热证（急性湿疹），脾虚湿阻证（亚急性湿疹），脾虚血燥证（慢性湿疹）3型。急性期为脾失健运，运化失司，湿浊内蕴，日久化热，浸于肌肤，久则生风化燥，脾虚血燥肌肤失养［8］。急性期以清热解毒、健脾渗湿为主，慢性期以健脾养血，祛风止痒为主，并在此基础上根据兼有症状加减已成为共识，治疗中不能一味地清热利湿［9］，基于特应性皮炎的症状特点，结合中医病因病机学说，临床用药规律和现代中医研究成果，脾虚是特应性皮炎患者的体质特征，慢性期脾虚血燥患者可能有不同程度的皮肤屏障功能障碍。瘙痒可促使淋巴细胞释放化学因子如白介素1а等，不但是瘙痒进一步加剧，而且导致湿疹样皮疹的产生和加重，并形成恶性瘙痒－搔抓循环。在长期的临床时间中观察到特应性皮炎患者大多表现为皮损肥厚、干燥、脱细屑、纳差、便溏等脾虚血燥证的表现。无论从中医基础理论分析还是多年的临床实践来看特应性皮炎的辨证治疗均紧密围绕以脾为主的辨治思路，慢性期则为久病耗伤脾气，气血生化之源受损，脾虚亦为血虚之本，而”血虚不能养肤，风从内生”，脾虚血燥贯穿特应性皮炎整个慢性期过程。近年来，特应性皮炎患病率居高不下，三岁以内的儿童患病率为44%［10］。现代医学研究表明，特应性皮炎病因学主要涉及皮肤的机械屏障和免疫屏障功能的异常［11］。

基于特应性皮炎的症状特点，结合中医病因病机学说，临床用药规律和现代中医研究成果，脾虚是特应性皮炎患者的体质特征，脾虚血燥患者可能有不同程度的皮肤屏障功能障碍。本文对脾虚血燥与皮肤机械屏障功能关系进行了实验研究。结果显示，皮肤机械屏障功能瘙痒模型组小鼠神经酰胺含量下降，瘙痒次数增多，表皮厚度增厚，与空白组比较，有明显统计学意义。治疗高、低剂量组及预防高、低剂量组的神经酰胺含量升高，瘙痒次数减少，表皮厚度变薄比较皮肤机械屏障功能瘙痒模型组小鼠有显著性差异。健脾养血祛风汤组成方药为云南省中医医院皮肤科已故刘复兴主任医师的经验方。其方健脾养血祛风止痒，健脾益血，水谷精微化生有源，津血同源，气血健运，津液濡润，肌肤腠理得养，皮肤屏障功能得以维持。

苦寒药致脾虚是目前最常用的脾虚造模方法。《脾胃论》：“大忌苦寒之药伤其脾胃。”临床过用苦寒及苦寒泻下常致耗气破气，脾胃气虚。大黄为苦寒泻下法中最常用的药物，其性寒味苦，含多量蒽醌衍生物。苦寒泻下法致致脾虚属脾气虚。

瘙痒是以特应性皮炎为代表的一类干燥性皮肤病的临床主要症状之一，也是皮肤屏障功能障碍的主要症状表现［12～13］，反复搔抓皮肤可使皮肤病变恶化和迁延，使瘙痒进一步加剧，本研究选用丙酮、乙醚混合液致小鼠皮肤瘙痒，原理基于皮肤与有机溶剂接触可提取皮肤脂质，致皮肤屏障功能显著降低［14］。通过复制大黄所致脾虚动物模型并进一步复制瘙痒（血燥）模型，通过程度其表皮神经酰胺含量这一皮肤屏障功能的重要指标，及表皮厚度、瘙痒行为，探讨脾虚血燥与皮肤机械屏障功能的关系。

中医药治疗特应性皮炎有其独特的优势，过去我们在对过敏性皮肤病的临床及实验研究中过分强调中药的抗炎、抗组胺作用，但抗炎、抗过敏难以体现中医药治疗过敏性皮肤疾病的优势。许多中药中药制剂在实验研究中确实表现出一定程度的抗炎、抗组胺的作用，可强度远不及抗组胺药、糖皮质激素类药物；在临床治疗上中药虽然起效慢，但远期疗效好，复发率低是客观事实，许多患者是在抗组胺药、糖皮质激素治疗无效的情况下，转用中药治疗而获效的，提示我们中药可能是通过其他途径发挥治疗作用的。

4 结论

健脾养血祛风法可以减轻大黄法所致脾虚血燥小鼠瘙痒程度，提高神经酰胺含量健脾养血祛风法能改善大黄法所致小鼠脾虚血燥证的皮肤机械屏障功能障碍。脾虚血燥证在研究脾虚与皮肤这一人体最大器官关系的动物模型尚不多，本实验为今后建立复合型及最大程度接近临床疾病症状，解释证的本质的研究，用动物模型提供了思路与依据。

［1］Seidenari S，Giusti G.Objective assess ment of t he skin of children affected by atopic der matitis：a study of p H，capacitance and TEWL in eczemat ous and clinically uninvolved skin.Acta Der m Venereol，1995；75（6）：429～433.

［2］Matsu moto M，Sugiura H，Uehara M.Skin barrier f unction in patients wit h co mpletely healed at opic der matitis.J Der matol Sci，2000；23（3）：178～182.

［3］Imokawa G.Lipid abnor malities in atopic der matitis.Ja m Acad Der matol，2001，45（1 suppl）：S29～S32.

［4］Blight EG，Dyer WJ.A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physiol，1959；37（8）：911～917.

［5］Miya mot o T，Noji ma H，Shinkado T，et al.Itch－associated response induced by experi mental dry skin in mice.Jpn J Phar macol，2002；88（3）：285～292.

［6］郑金海，宋小东，李庆丰 .大黄致脾虚及四君子汤复健小鼠血浆中CA MP与脾PFC含量的变化［J］.兰州大学学报，1994；30（4）108～110.

［7］陈小野，周永生，樊雅莉，等 .脾气虚证动物模型规范化的初步研究［J］.中国医药学报 .2001；16（4）：52.

［8］安家丰，张芃 .张志礼皮肤病医案选萃［M］.北京：人民卫生出版社，1996，131～132.

［9］龚丽萍 .益气养阴、健脾活血法治疗异位性皮炎［J］.实用中西医结合临床.2004；4（6）：50～51.

［10］Liselott BH，Lotte L，Frederik F，et al.Develop ment of atopic dermatitis during the first 3 years of life：the Copenhagen prospective st udy on ast h ma in childhood cohort st udy in high－risk children.Arch Der matol 2006；142：561～566.

［11］Jensen JM，Folster－ Holst R，Baranowsky A，et al.Impaired sphingo myelinase activity and epider mal differentiation in atopic der matitis.J Invest Der matol，2004；122（6）：1423～1432.

［12］Sege JA.Epider mal barrier f or mation and recover y in skin disorders.J Clin Invest；2006，116（5）：1150～1158.

［13］Rawlings AV，Handing CR.Moisturization and skin barrier f unction.Der matol Ther；2004，17（1）：43～48.

［14］Abrams K，Harvell，JD，Shriner，D，et al.Dissolution of materials in artificial skin surface fil m liquids.J Invest Der matol；1993；101：609～613.