清开灵注射液对LPS诱导的兔弥散性血管内凝血的作用*

孙 浩，王 珣，柳佳利，林 熙

(暨南大学医学院药理学系，广东广州510632)

弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是由不同病理原因引起的、无明确定位的全身性血管内凝血系统激活和微血栓形成，临床上以出血和血栓并存，以及多器官功能衰竭为特征的综合征［1］。目前已证明DIC和炎症反应关系密切，在危重的DIC患者中，炎症反应在其病理生理进展中发挥重要作用［2－3］。DIC具有起病急骤、发展迅速、预后极差、死亡率高的特点。目前临床上对其主要采用抗凝治疗，其代表类药物为肝素。但应用肝素治疗时副作用明显，常可加重患者出血倾向。

清开灵注射液为中成药制剂，主要成分为胆酸、珍珠母、猪去氧胆酸、板兰根、金银花等。近年来有研究发现清开灵注射液能够通过抑制全身炎症介质所介导的炎症细胞黏附以及内皮损伤，从而有效的减轻全身炎症反应［4］。以上提示清开灵注射液可能可以通过减轻全身炎症反应来起到抗DIC的作用。

DIC的治疗主要针对高凝期，此期凝血系统被激活，凝血酶产生增多，血液中凝血酶含量增高，血液表现为高凝状态，微循环中形成大量微血栓，易造成血管栓塞以及多器官功能衰竭［5］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的DIC模型主要是模拟DIC的高凝期，本课题组拟通过注射LPS建立家兔DIC模型，观察家兔凝血系统相关指标以及血浆丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血尿素氮(blood urine nitroge，BUN)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF－α)的变化，从而证实清开灵注射液对LPS诱导家兔DIC的拮抗作用。

材料和方法

1 动物

健康雄性新西兰家兔60只，体重2．0～2．5 kg，由广东省医学实验动物中心提供，粤检证字［SCXK(粤)2008－0002］。

2 试剂及仪器设备

清开灵注射液购于北京中医药大学药厂，批号611013A;LPS购于Sigma;肝素购于中国医药工业有限公司;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ(antithormbinⅢ，ATⅢ)活性检测试剂盒购于上海太阳生物技术公司;ELISA试剂盒(tumor necrosis factorα，TNF－α)购于BD Biosciences。Sysmex CA1500+CA6000全自动凝血分析仪(KOBE);Sysmex SE－9500全自动血细胞分析仪(KOBE);HITACHI 7170全自动血浆分析仪(HITACHI)。

3 主要方法

3．1 动物模型的建立 参照Hermida等［6］方法，用LPS诱导家兔DIC。3%戊巴比妥钠按30 mg/kg从家兔耳缘静脉注射麻醉，分离右侧颈动脉、插管，以备取血。LPS溶于60 mL生理盐水中，然后以100 μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度从家兔耳缘静脉滴注，连续6 h给药，建立稳定的家兔DIC模型。给药后2 h、4 h给予戊巴比妥钠腹腔注射，维持动物的持续麻醉状态。

3．2 动物分组 将家兔随机分6组，每组10只(1)正常对照组:(2)DIC模型组:(3)低剂量清开灵注射液治疗组;(4)中剂量清开灵注射液治疗组;(5)高剂量清开灵注射液治疗组;(6)肝素对照组。

3．3 给药方法 (1)正常对照组:从家兔双侧耳缘静脉以10 mL/h的速度滴注生理盐水(既不注射LPS，也不注射清开灵注射液和肝素，连续6 h)。(2)DIC模型组:从家兔一侧耳缘静脉以100μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注 LPS，同时从对侧耳缘静脉以10 mL/h的速度滴注生理盐水，连续6 h。(3)低剂量清开灵注射液治疗组:将清开灵注射液溶于60 mL生理盐水，从家兔一侧耳缘静脉滴注LPS 的同时，从对侧耳缘静脉以 0．5 mL·kg－1·h－1的速度滴注清开灵注射液(10 mL/h)，连续6 h给药。(4)中剂量清开灵注射液治疗组:将清开灵注射液溶于60 mL生理盐水，从家兔一侧耳缘静脉滴注LPS 的同时，从对侧耳缘静脉以 1．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清开灵注射液(10 mL/h)，连续6 h。(5)高剂量清开灵注射液治疗组:将清开灵注射液溶于60 mL生理盐水，从家兔一侧耳缘静脉滴注LPS的同时，从对侧耳缘静脉以 2．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清开灵注射液(10 mL/h)，连续6 h给药。(6)肝素对照组:将肝素溶于60 mL生理盐水中，从家兔一侧耳缘静脉滴注LPS的同时，从对侧耳缘静脉以6 ×105U·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注肝素，连续6 h。

3．4 观察指标和样品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分别从动脉取血1 mL，置于含有1/10体积的枸橼酸钠抗凝液的塑料管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，待测血浆－20℃保存。用Sysmex CA1500+CA6000全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和纤维蛋白原含量;用Sysmex SE－9500全自动血细胞分析仪进行血小板(platelet，PLT)计数;用HITACHI 7170全自动血浆分析仪测定血浆ALT以及BUN含量;用发色底物法测定血浆蛋白C及ATⅢ的活性;用ELISA试剂盒检测血浆TNF－α含量，同时记录24 h内各组动物生存率。

4 统计学处理

数据用均数±标准差表示。应用SPSS 13．0统计软件对资料进行分析，用方差分析检测各组差异是否显著，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 清开灵注射液对LPS诱导的DIC兔生存率的影响

DIC模型组在24 h时的动物生存率为30%;清开灵注射液高、中、低剂量3组在24 h时的动物生存率分别为90%、50%和40%，见图1。高剂量清开灵注射液治疗组动物的24 h内生存率明显升高(P＜0．05 vs DIC)，见图1;肝素组在24 h时的动物生存率为80%，见图1;正常对照组动物在24 h时的动物生存率为100%(图中未显示)。

Figure 1．Effect of Qingkailing injection on survival rate of the rabbits with LPS－induced DIC．*P＜0．05 vs DIC．图1 清开灵注射液对LPS诱导的DIC兔生存率的影响

2 清开灵注射液对LPS诱导的兔DIC凝血系统的影响

2．1 APTT和PT DIC模型组注射LPS2 h、6 h后，APTT分别为(20.52±6.12)s和(32.17±6.18)s，与正常对照组［(13.36±1.43)s和(14.30±1.02)s］比较均明显延长(P＜0.05)，见表1;DIC模型组PT值分别为(16.24±5.31)s和(23.38±6.11)s，与正常对照组［(9.01±1.72)s和(9.53±1.32)s］比较均明显延长(P＜0.05)，见表1。用清开灵注射液给药2 h后，高剂量组APTT和PT明显缩短;给药6 h后，低剂量组和中高剂量组APTT显著缩短，中剂量组和高剂量组PT显著缩短(P＜0.05 vs DIC)，见表1。肝素组在给药6 h后APTT和PT亦明显缩短(P＜0.05 vs DIC)，见表1。

2．2 血小板计数 DIC模型组注射LPS2 h、6 h后，血小板计数分别为(332.16±53.42)×109/L和(180.53±42.65)×109/L，与正常对照组［(465.71±70.87)×109/L和(482.21±94.90)×109/L］相比显著下降(P＜0.05)，见表1。注射清开灵注射液2 h后，中高剂量组血小板计数明显升高;给药6 h后，各组血小板计数都显著升高。肝素组在给药2 h后血小板计数明显升高，给药6 h后显著升高(P＜0.05 vs DIC)，见表 1。

2．3 纤维蛋白原含量 DIC模型组注射LPS 6 h后纤维蛋白原含量为(2.01±0.38)g/L，与正常对照组［(4.62±1.41)g/L］相比明显降低(P ＜0.05)，见表1。注射清开灵注射液6 h后低剂量组纤维蛋白原含量明显升高，中高剂量组纤维蛋白原含量显著升高(P＜0.05 vs DIC)，见表1。肝素组在给药6 h后纤维蛋白原含量明显升高(P＜0.05 vs DIC)，见表1。

2．4 血浆蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性 DIC模型组注射LPS 2 h和6 h后，血浆蛋白 C水平分别为(52.73±15.30)%和(38.84±13.36)%，与正常对照组［(96.54±10.15)%和(98.32±7.63)%］相比明显降低(P＜0.05)，见表1;抗凝血酶Ⅲ的活性水平分别为(76.18±15.32)%和(48.83±12.73)%，与正常对照组［(101.32±4.32)%和(98.42±5.01)%］相比明显降低(P＜0.05)，见表1。注射清开灵注射液后，各组血浆蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性水平均显著升高(P＜0.05 vs DIC)，见表1。肝素组在给药后血浆蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性明显升高(P＜0.05 vs DIC)，见表1。

表1 清开灵注射液对LPS诱导的兔DIC凝血系统的作用Table 1．Hemostatic parameters 2 h and 6 h after LPSinfusion into rabbits in different treatment groups(¯x±s．n=10)

3 清开灵注射液对LPS诱导的兔DIC血浆ALT及BUN的影响

DIC模型组注射 LPS 2 h、6 h后血浆 ALT及BUN均明显升高(与正常对照组相比);注射清开灵注射液2 h后，高剂量组血浆ALT活性与DIC模型组相比明显下降(P＜0．05)，见图2。注射清开灵注射液6 h后，各组血浆ALT活性与DIC模型组相比均明显下降(P＜0．05)，见图2。注射清开灵注射液6 h后，各组BUN与DIC模型组相比均明显下降(P＜0．05)，见图 3。

Figure 2．Effect of Qingkailing injection on the plasma level of ALT in LPS－induced DICrabbits．¯x±s．n=10*P＜0．05 vs DIC group．图2 清开灵注射液对LPS诱导的DIC兔血浆ALT活性的影响

Figure 3．Effect of Qingkailing injection on BUN in LPS－ induced DIC rabbits．¯x±s．n=10．*P＜0．05 vs DIC group．图3 清开灵注射液对LPS诱导的DIC兔BUN的影响

4 清开灵注射液对LPS诱导的兔DIC血浆TNF－α含量的影响

DIC模型组注射LPS 2 h、6 h后血浆TNF－α含量分别为(76．68 ±20．36)pg/L 和(436．82 ±42．67)pg/L，与正常对照组［(31．05 ±12．38)pg/L 和(38．26±10．73)pg/L］相比明显升高(P ＜0．05)，见图4。注射清开灵注射液2 h后，低中剂量TNF－α含量明显降低，高剂量组显著降低;给药6 h后，各组TNF－α含量都显著降低(P＜0．05 vs DIC)，见图4。肝素组给药2 h后TNF－α含量明显降低，给药6 h后TNF－α含量显著降低(P＜0．05 vs DIC)，见图4。

Figure 4．Effect of Qingkailing injection on the plasma levels of TNF－αin LPS－induced DICrabbits．¯x±s．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．图4 清开灵注射液对LPS诱导DIC兔血浆TNF－α含量的影响

讨 论

DIC是由不同病理原因引起的综合征，表现为全身性血管内凝血系统激活和微血栓形成，临床上以出血和血栓并存，以多器官功能衰竭为特征［1］。本实验在静脉持续滴注LPS后，APTT和PT呈进行性延长，血小板计数和纤维蛋白原含量显著降低;ALT和BUN显著升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明显降低;血浆TNF－α含量明显升高。这符合DIC的病理生理过程，并与Hermida等［6］的研究结果一致。表明本研究建立了稳定的兔DIC模型。

APTT能反映血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ水平，是评价内源凝血系统较为敏感和最常用的指标，PT反映血浆中凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、X水平，是评价外源性凝血系统较为敏感和常用的指标［8－9］。与DIC模型组相比，注射清开灵注射液后各组APTT和PT都明显缩短，表明清开灵注射液能够抑制DIC时凝血因子的消耗，提升血浆凝血因子水平。

血小板是凝血反应的关键点，在DIC的发生发展过程中，由于凝血途径的激活，凝血酶大量生成，导致了血小板聚集，从而使血小板减少。纤维蛋白原是凝血反应的最终产物，也是血栓的主要成分［7］。与DIC模型组相比，注射清开灵注射液后各组的纤维蛋白原含量和血小板计数都明显升高，并且随着清开灵注射液剂量的增加，升高的程度更明显。这提示清开灵注射液可以减轻DIC所致的凝血反应、减少凝血物质的消耗。

蛋白C是人体内一种重要的抗凝因子，约占血液抗凝活性的20%～30%，其以无活性的酶原形式存在于血浆中，可在凝血酶作用下转变为活化蛋白C(activated protein C，APC);ATⅢ由肝细胞和血管内皮细胞分泌，是人体内另一重要的生理性抗凝物，生理条件下ATⅢ主要在血管内皮细胞表面通过灭活凝血因子而发挥抗凝作用，其负责血浆中约7O%～75%的抗凝作用。DIC的发生可使蛋白C和ATⅢ活性减低，从而减弱其对于凝血反应的抑制作用［10］。清开灵注射液使LPS所诱导的兔DIC的蛋白C和ATⅢ升高，提示清开灵注射液能够增强抗凝物质的作用来拮抗LPS所诱导的兔DIC的凝血反应。

BUN是一种衡量肾小球滤过率的指标，当BUN升高时，提示肾实质受损害;ALT是检查肝功能的灵敏度较高的指标，正常时血清含量很低，当ALT升高时，提示肝细胞受到损害［11］。清开灵注射液使LPS所诱导的兔DIC的ALT和BUN显著下降，提示清开灵注射液可以在LPS所诱导的兔DIC发生时保护肾实质、减少肝细胞的破坏，从而减少肝脏肾脏等重要器官的损害。

促炎介质在DIC发生发展过程中起着重要的作用，各种促炎介质通过活化内皮细胞、促进凝血及补体活化等作用使机体产生全身炎症反应，从而导致DIC的发生［11］。TNF－α是内毒素血症时一个早期的促炎因子，是诱发机体抵抗病原微生物的重要生物活性物质，它可以诱导其它炎症介质的表达，从而在DIC的发生和发展过程中发挥重要作用［12］。持续的TNF－α高表达会造成严重的后果，如多器官功能衰竭和死亡［13］。与DIC模型组相比，用清开灵注射液所治疗3组的血清TNF－α含量都明显下降，随着清开灵注射液剂量的增加，血清TNF－α含量下降的程度更加明显。从而提示清开灵注射液可以通过减少促炎介质的表达来起到对LPS所致的兔DIC的拮抗作用。

综上所述，在LPS所致的兔DIC模型中，清开灵注射液可以使APTT和PT明显缩短;血小板计数和纤维蛋白原含量明显升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明显增强;ALT、BUN、TNF－α水平明显降低。这可能是与清开灵注射液可以降低促炎因子的水平从而减少其它炎症介质的产生、减少凝血物质的消耗、抑制凝血系统的激活以及促进抗凝系统的激活有关。清开灵注射液可以保护LPS所致的DIC发生时肝肾等重要脏器，提高生存率，表明清开灵注射液对LPS所致的DIC有明显的拮抗作用，在DIC的预防与早期治疗中有良好的应用前景。

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