人膝骨关节炎血清生物学标志物的筛选*

曾 花， 蔡道章， 陈郁鲜， 曾 春， 叶志强， 庄 泽， 黎明涛， 胡坤华

(中山大学附属第三医院1急诊科，2骨科，广东广州510630;3中山大学中山医学院蛋白质组学研究中心，广东广州510080)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由于机械和生物性因素共同作用所导致的关节软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨合成和降解动态失衡所致的全关节疾病［1］。OA以中老年患者多见，且女性多于男性，60岁以上人群患病率可达50%，75岁以上人群则达80%，该病的致残率可高达53%，好发于负重大、活动多的关节，如膝、脊柱、髋、踝、手等关节［2］。发展到中晚期的OA往往需要手术来减轻疼痛、矫正畸形和改善关节功能，但手术不仅给患者带来沉重的经济负担，也不能很好地解决关节软骨的修复和重建问题。然而OA的发病机制目前尚不明确，缺乏有效的生物学标志物及早期诊断和治疗的方法，因此采取新的方法和手段阐明OA的发病机制，发现新的疾病诊断标志物对提高OA患者的生活质量有重要意义。蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴科学，是对生物体在蛋白质水平上定量、动态、整体性的研究，同时也能为阐明众多疾病的发病机制提供理论根据和解决途径。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D－DIGE)联合基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱(matrix－assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)，成功建立了OA血清差异蛋白质组学的研究方法，通过对筛选出的差异蛋白的进一步研究，为发现新的诊断标记物和药物治疗靶点，以及发病机制的研究提供重要线索。

材料和方法

1 材料和仪器

1．1 主要试剂 十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、过硫酸铵、丙烯酰胺、N，N'－亚甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸等均购自Sigma;去血清高峰度蛋白试剂盒ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit购自Merck;蛋白质纯化试剂盒Clean－up Kit、蛋白定量试剂盒2D Quant Kit、荧光标记试剂盒CyDye DIGE Fluor Labeling Kit、固相pH值干胶条、IPG buffer等均购自 GE，α2－巨球蛋白(α2－macroglobulin，α2M;ab36995)Ⅰ抗购自Abcam，Ⅱ抗购自Jackson。

1．2 主要仪器和设备 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALTsix垂直电泳系统、Typhoon 9400型多功能激光扫描仪、DIGE分析软件DeCyder 6．0和全自动斑点工作站Ettan Spot Handing Workstation均为GE产品，质谱仪Ultraflex III为布鲁克产品;电泳凝胶成像分析系统Tanon－2500为上海天能科技有限公司产品。

2 方法

2．1 实验对象 从中山大学附属第三医院骨科住院治疗的30例诊断明确膝骨关节炎患者中随机抽取4例组成本研究的OA实验组，并根据实验组挑选年龄、性别和体重指数(body mass index，BMI)分别对应匹配的4例健康志愿者组成本研究的对照组。本实验标本的获取均已征得入组人员的同意，符合相关卫生部门的伦理委员会原则。

实验组需满足的条件:(1)诊断明确的骨关节炎患者:临床诊断参照2007年《骨关节炎诊疗指南》［2］;(2)无类风湿性关节炎等结缔组织病;(3)无肝肾功能不良，免疫系统疾病;(4)抽血前1周内未曾使用过非甾体类镇痛药、糖皮质激素等;(5)无药物过敏史;(6)非孕妇、哺乳期、月经期妇女;(7)既往无关节感染、结核、关节创伤手术史。对照组需满足的条件:无包括骨关节炎在内的关节疾病的现病史和既往史。

2．2 样品实验前处理 所有血清样本取清晨空腹静脉血3 mL，室温下静置1 h，4℃、2 500×g离心15 min取上清，用0．2 mL EP管分装，－80℃保存备用。集齐血清样本后，用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit试剂盒去除高丰度蛋白，然后对样本进行纯化和定量，随后按荧光标记试剂盒说明书对蛋白样品进行CyDye荧光标记。2D－DIGE的实验设计为:从正常对照组N1～N4和OA实验组A1～A4 8个血清样本中各取25μg蛋白共200μg进行Cy2荧光标记，作为内参照(消除胶与胶之间的差异);取N1、N2、A3、A4 4个血清样本各50μg蛋白进行 Cy3荧光标记;取 A1、A2、N3、N4 4个血清样本各50 μg蛋白进行Cy5荧光标记(交叉标记以消除不同荧光染色效率不同的误差)。50μg Cy2标记的内参照、Cy3标记的N1和Cy5标记的A1混合后进行双向电泳分离，命名为胶1;同理，内参照、N2和A2混合后为胶2，内参照、A3和N3混合后为胶3，内参照、A4和N4混合后为胶4。

2．3 2D－DIGE双向电泳 选择pH 4～7、24 cm的IPG胶条对血清样品蛋白质进行第一向等电聚焦(isoelectric focusing，IEF);IEF 参数设置为:30 V、6 h;60 V、6 h;200 V、1 h;500 V、2 h;1 000 V、2 h;3 500 V、2．5 h;10 000 V、1 h;10 000 V、8 h;500 V、12 h;78 350 VHr收胶。IEF完成后，在平衡缓冲液中平衡胶条，将其转移至12．5%SDS－PAGE胶上进行第二向电泳，电泳参数设置为:第一步蛋白转移:2 W/gel，电泳时间 50 min;第二步垂直电泳:17 W/gel，电泳直至溴酚蓝跑出凝胶下缘10 min(注:2D－DIGE凝胶的电泳在避光条件下进行)。

2．4 图像采集与分析 用Typhoon 9400型多功能激光扫描仪凝胶蛋白图像，使用ImageQuant软件收集凝胶蛋白图像，使用DeCyder 6．0软件对凝胶蛋白图谱进行分析，选取蛋白丰度差异＞1．2倍的蛋白质斑点、t检验 P＜0．05的斑点作进一步分析。

2．5 差异蛋白点质谱图的获取及质谱数据的分析

在Spot Handling Workstation中切取差异蛋白点，将切取的蛋白点进一步酶解，使用Bruker的Ultraflex III质谱仪对酶解样品进行MALDI－TOF－MS分析，获得样品的肽质量指纹图谱(peptide mass figerprinting，PMF)。所获得图谱使用Biotools软件检索，以Mascot(http://www．matrixscience．com)为搜索引擎在数据库 Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)中检索，检索种属为human。

2．6 Western blotting分析 取30μg血清样品蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE电泳)后转印至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭该膜37℃ 1 h，冲洗后加入Ⅰ抗稀释液(稀释度1∶2 000)4℃孵育过夜后，再加入相应的Ⅱ抗稀释液37℃ 孵育1 h。经ECL显影后，用电泳凝胶成像分析系统分析灰度值。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(¯x±s)表示，采用软件SPSS13．0进行统计学分析，均数比较采用独立样本t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 2D－DIGE图像采集及蛋白表达

依照2D－DIGE实验设计，依次进行实验样品的CyDye荧光染色、第一向IEF电泳、第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)和2D－DIGE凝胶的扫描，得到分别由Cy2、Cy3和Cy5标记的不同血清蛋白样品的蛋白斑点图和不同荧光叠置所得的胶内差异图像，按实验设计进行电泳所得的4张2DDIGE凝胶的荧光叠置图像，各胶检测到的蛋白斑点数分别为1567、1587、1583和1675，实验各胶的匹配率达71%。经DeCyder软件分析两组间蛋白丰度差异大于1．2倍，且具有统计学意义的点共有14个，其中有9个蛋白点在OA实验组表达上调，它们在胶上的编号为:318、536、546、757、769、773、912、916 和9175;5个蛋白点在OA实验组表达下调，它们在胶上的编号为:657、974、1196和1221。差异蛋白点在2D－DIGE凝胶上的具体位置，见图1。

Figure 1．The full view of protein spots．The marked spots were identified．图1 差异蛋白点在2D－DIGE凝胶的具体位置

2 质谱鉴定联合数据库匹配分析结果

进行MALDI－TOF－MS鉴定的14个斑点均获得了较好的图谱，这些图谱以Mascot(http://www．matrixscience．com)为搜索引擎，联合检索数据库Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)初步鉴定出OA实验组与对照组间蛋白丰度差异大于1．2倍且有统计学意义的点共8个，其中有5个蛋白在OA组表达上调，3个蛋白在OA组表达下调，见表1。双向电泳能根据分子量和等电点对蛋白质进行二维分离，蛋白质经过磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰后等电点和分子量与原始状态相比会出现偏差，在双向电泳图谱上表现为在不同位置出现的蛋白斑点。例如本研究中α2－macroglobulin分别在5个位置出现，inter－alpha－trypsin inhibitor heavy chain 4和kininogen－1分别在2个位置出现，但经质谱鉴定均为同一种蛋白。

表1 差异表达蛋白质谱鉴定Table 1．Results of MALDI－TOF－MSanalysis

3 Western blotting实验结果

我们进一步采用临床样本进行了Western blotting验证，结果表明，OA患者血清中α2M明显高于正常对照，见图2。

Figure 2．Expression ofα2 M in the sera of OA patients and the controls detected by Western blotting．N:control group;A:OA group．¯x±s．n=15．*P＜0．05 vs control．图2 Western blotting检测α2 M的表达

讨 论

随着全球向老龄化社会的发展，OA已成为中老年人慢性残障最常见的原因之一。有研究结果统计显示，在所有导致老年残障的疾病中，单纯的膝骨关节炎的致残率仅次于心血管疾病，处于第2位［3］，给家庭和社会带来沉重的负担。但对于骨关节炎的预防、早期诊断及治疗目前仍缺乏高效的方法。因此，对于骨关节炎，尤其是对膝骨关节炎等大骨关节关节炎的预防、早期诊断、早期治疗及发病机制的深入研究具有重大意义，关于这方面的研究也越来越受到我国乃至全球医疗机构和科研机构的重视。目前，关于OA的研究大多数以涉及OA病理改变的软骨、滑膜为中心而展开的，实验主要针对这些组织中的一种或几种因素与OA的关系，而且是基于某种假定成立的预期理论进行的，这些研究的目的也是为了证实或者否定这些假定的理论。然而，蛋白质组学这一高通量、高敏感性和高精确度研究方法的出现，打破了传统研究手段的限制，利用蛋白质组学技术可同时检测不同样品不同状态下成千上万的蛋白，这一技术的出现有利于新的蛋白生物学标志物、新药物治疗靶点及新作用机制的发现。目前，我国已有不少研究将蛋白组学的相关技术应用于各种疾病诊断及治疗的研究中，如梁琼等［4］等利用蛋白组学技术寻找骨肉瘤恶性生物学行为的分子标记物;张晓雪等［5］利用蛋白组学技术筛选类风湿关节炎患者血清特异性标志物;而胡志成等［6］则利用蛋白组学技术寻找病理性瘢痕形成机制中的特异蛋白为病理性瘢痕形成机制提供了新的思路。同时国内外也有不少研究将蛋白组学技术应用于OA的相关研究中，但大多数研究不约而同地选择了涉及OA病理改变的软骨、滑膜、关节液作为研究对象，多数理论也认为OA是关节软骨的局部病变。但是，目前仍没有任何一种关于OA的发病机制的假设理论经研究证实是一定成立的。因此，本研究突破以往研究思路的限制，选择血清蛋白作为研究对象，期望能通过对OA血清蛋白质组学的比较分析，为OA发病机制的研究提供新的思路和实验基础，寻找新的OA疾病相关蛋白，筛选出能用于OA诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标记物。

本研究采用2D－DIGE联合MALDI－TOF－MS的比较蛋白组学研究方法，成功建立了OA患者血清双向荧光胶内差异凝胶电泳技术体系，获得了分离效果良好、清晰的蛋白斑点图谱，每张胶均检测到数以千计的蛋白点，且胶与胶之间的蛋白斑点匹配率较高，通过DeCyder软件找到了OA患者血清中8个具有显著差异表达的蛋白点，成功建立了OA血清差异蛋白组学的研究方法，为寻找OA血清生物标记物和OA疾病相关蛋白质的研究提供了实验基础。

经生物信息学检索显示，本研究所鉴定的在OA患者血清中差异表达的8个蛋白均直接或间接地参与机体的炎症反应、细胞凋亡、自身免疫反应，提示骨关节炎的发病机制与机体的炎症反应、细胞凋亡及自身免疫反应有着密切的关系。而通过对其它应用蛋白组学进行的OA相关研究的文献与本研究比较发现，α2M极有可能为OA的早期诊断提供新的生物学标记物，为OA的早期治疗提供新的药物治疗靶点，同时也为OA发病机制的研究提供了新的线索，然而其具体应用价值尚需大量的后续实验研究工作。

α2M是由肝脏内皮细胞分泌的广谱蛋白酶抑制剂，主要存在于血浆中，参与机体的免疫反应过程［7－8］，为 IL －1/IL －8/TNF 等炎症因子提供结合位点，有研究表明其与阿尔茨海默病的发病有关［9－10］。

虽然骨关节炎的发病机制目前尚不明确，但大多数研究发现骨关节炎的发生主要是由软骨细胞外基质胶原和聚集蛋白聚糖的丢失引起的［11］。软骨聚集蛋白是由ADAMTS－4/5、ADAMTS－7/12等聚集蛋白聚糖酶降解，ADAMTS－4/5的抑制剂对软骨蛋白聚糖的分解和代谢起调节作用，任何情况的抑制阻断将会加速软骨聚集蛋白聚糖的降解，之前TIMP－3是唯一一个被发现的ADAMTS－4/5内源性抑制剂，目前研究发现α2M是另一个抑制剂［12］。另有研究证明，α2M是一个新发现ADAMTS－7/12的底物，两者结合可抑制ADAMTS－7/12对COMP的降解，同时α2M也是一种重要的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)清除剂，参与 OA的病理过程［13］。张洪等［14］通过比较兔膝骨关节炎软骨与正常兔膝软骨，发现软骨细胞中α2M的表达在兔膝骨关节炎模型组阳性率均高于对照组，同时实验组软骨细胞凋亡的程度与α2M的表达呈负相关，表明α2M与骨关节发生发展有密切关系。林子洪等［15］通过对创伤性兔膝骨关节炎模型采用α2M关节内注射与阴性对照比较，发现α2M治疗组的半月板退变速度稍慢，半月板纤维和细胞情况较好，其对关节炎症有直接的抑制作用，但对滑膜炎症的抑制作用较弱，提示α2M可能适合OA发病初期的保护性治疗和研究。而李蔚勃等［16］通过文献研究分析总结α2M对骨关节炎的影响可能是通过抑制MMP参与自由基的清除，通过转运细胞因子调节MMP1的合成与代谢参与免疫过程，但其具体机制尚待进一步研究。

本实验OA组血清α2M的升高，可能是由于OA机体自身对抗疾病的一个保护性机制导致其分泌增多，而其是否与关节软骨局部的表达水平一致，以及与OA发病机制的具体关系尚待进一步研究。

［1］ 朱振安．重视膝关节骨关节炎的早期防治［J］．中国骨伤，2010，23(12):887 －889．

［2］ 中华医学会骨科分会．骨关节炎诊治指南(2007年版)［J］．中华关节外科杂志，2007，27(10):793 －796．

［3］ Guccione AA，Felson DT，Anderson JJ，et al．The effects of specific medical conditions on the functional limitations of elders in the framingham study ［J］．Am J Public Health，1994，84(3):351 －358．

［4］ 梁 琼，李 扬，王连唐，等．骨肉瘤组织与良性骨肿瘤的比较蛋白质组学研究［J］．中国病理生理杂志，2009，25(6):1089 －1093．

［5］ 张晓雪，袁兆林，朱 敏，等．运用蛋白指纹图谱技术筛选类风湿关节炎患者血清特异性标志物［J］．中国病理生理杂志，2010，26(9):1818－1823．

［6］ 胡志成，朱家源，朱 斌，等．病理性瘢痕与正常皮肤的蛋白组学研究［J］．中国病理生理杂志，2011，27(9):1802－1806．

［7］ Dodds AW，Law SK．The phylogeny and evolution of the thioester bond－containing proteins C3，C4 andα2－macroglobulin［J］．Immunol Rev，1998，166:15 －26．

［8］ Mocchegiani E，Ciavattini A，Santarelli L，et al．Role of zinc andα2macroglobulin on thymic endocrine activity and on peripheral immune efficiency(natural killer activity and interleukin － 2 in cervical carcinoma［ J］．Br J Cancer，1999，79(2):244 －250．

［9］ Singleton AB，Gibson AM，McKeith IG，et al．α2－Macroglobulin polymorphisms in Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies［J］．Neuroreport，1999，10(7):1507－1510．

［10］ Rudrasingham V，Wavrant－De Vriéze F，Lambert JC，et al．α － 2 macroglobulin gene and Alzheimer disease［J］．Nat Genet，1999，22(1):17 －19．

［11］ Tortorella MD，Arner EC，Hills R，et al．α2－ Macroglobulin is a novel substrate for ADAMTS－4 and ADAMTS－5 and represents an endogenous inhibitor of these enzymes［J］．J Biol Chem，2004，279(17):17554 －17561．

［12］ Luan Y，Kong L，Howell DR，et al．Inhibition of ADAMTS－7 and ADAMTS－12 degradation of cartilage oligomeric matrix protein by alpha－2－macroglobulin［J］．Osteoarthritis Cartilage，2008，16(11):1413 －1420．

［13］ Abbink JJ，Kamp AM，Nieuwenhuys EJ，et al．Predominant role of neutrophils in the inactivation ofα2－macroglobulin in arthritic joints［J］．Arthritis Rheum，1991，34(9):1139－1150．

［14］ 张 洪，张阳德，张宗久，等．α2M在骨关节炎动物模型中的表达及意义［J］．中国现代医学杂志，2008，18(1):40 －41，46．

［15］ 林子洪，何爱珊，傅 明，等．前交叉韧带切除后半月板变化及α2－巨球蛋白干预效果的初步研究［J］．中华关节外科杂志:电子版，2010，4(1):93 －99．

［16］ 李蔚勃，曹佩华，曹峻岭．α－2巨球蛋白对骨关节炎的影响［J］．国外医学:医学地理分册，2006，27(1):1 －5．