HPLC法测定阿达帕林凝胶中药物的体外透皮吸收量

肖学成 陈凤 李丹 李金

湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065

HPLC法测定阿达帕林凝胶中药物的体外透皮吸收量

肖学成 陈凤 李丹 李金

湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065

目的建立阿达帕林凝胶体外透皮接收液中药物的HPLC测定方法，研究阿达帕林凝胶体外透皮能力。方法采用Global C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水-四氢呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸调节pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm。体外透皮实验采用改良的Franz扩散池，以实验用离体乳猪皮为透皮屏障，自制凝胶与市售凝胶的透皮结果对比，分别在不同时间点取样测定透皮接收液中阿达帕林浓度，计算累积透皮量。结果阿达帕林的标准曲线方程为A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），线性范围0.189～2.268μg/mL，平均回收率为99.93%。累积透皮吸收量与时间呈良好的线性关系，自制凝胶与市售凝胶的透皮结果差异无统计学意义。结论该检测方法操作简便，快速准确，是考察阿达帕林凝胶体外透皮性能的较理想的方法。

阿达帕林；透皮吸收；高效液相色谱法

阿达帕林（Adapalene，CD271）是一种新的萘甲酸衍生物，属第三代维A酸类药物，与维A酸相比其基本分子结构已被广泛修饰。外用制剂为0.1%阿达帕林凝胶具有较好的抗炎，改善表皮角质形成细胞（角朊细胞）的分化能力，临床显示对痤疮有良好疗效，尤其适用于轻、中度痤疮的治疗[1]，较其他维A酸有更好地耐受性和更低的毒副作用[2]。因此准确有效地测定阿达帕林外透皮量具有重要意义，本研究建立了透皮接受液中阿达帕林的HPLC测定方法，研究了阿达帕林的体外透皮吸收情况，为临床使用提供了实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HH型恒温电热水浴器（上海互佳仪器设备有限公司）；HJ-5多功能磁力搅拌器（金坛市金祥龙电子有限公司）；改良的Franz立式扩散池[3]；戴安P680型高效液相色谱仪；ALC-110.4型电子天平（ACCULAB）。

1.2 试样

市售阿达帕林凝胶（法国高德美药业股份有限公司），批号：9051033；自制阿达帕林凝胶；0.9%NaCl水溶液（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；四氢呋喃（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；阿达帕林对照品（中国药品生物制品检定所）。

1.3 动物

实验用小型巴马香猪：普通级，健康，雄性，2个月，体重5.8 kg，由重庆宗申医达生物技术研发有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Global C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水-四氢呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸调节pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm；进样量：20μL。

2.2 对照品储备液的配制

精密称定阿达帕林对照品30.08mg置于1 000mL容量瓶内，加生理盐水溶解并稀释至刻度，即得浓度为30.08μg/mL的溶液，作为对照品储备液。

2.3专属性试验

2.3.1 对照品溶液的制备

精密量取“2.2”项下对照品储备液2 mL置于50 mL容量瓶中，加生理盐水-无水乙醇（50∶50）溶解并稀释至刻度，即为浓度为1.203 2μg/mL的对照品溶液。

2.3.2 样品溶液的制备

称取约为0.5 g的阿达帕林凝胶，将其均匀涂布于固定在Franz扩散池的猪皮上，12 h后取适量接收液通过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.3.3 空白基质液的制备

分别取上述对照品溶液、样品溶液、空白基质液各20μL进样，记录色谱图，结果见图1。

结果表明在此色谱条件下，空白基质不会对皮肤产生影响，且空白基质在阿达帕林主峰处无吸收峰，故对阿达帕林的含量测定无干扰。

2.4 标准曲线的制备

精密量取“2.2”项下对照品储备液各2、1、2、2、3、2 mL分别至250、100、100、50、50、25mL的量瓶中，加生理盐水溶解摇匀并稀释至刻度，得到一组浓度分别为0.240 64、0.300 80、0.601 60、1.203 20、1.804 80、2.406 40μg/mL的对照品溶液。分别进样20μL，以浓度C（μg/mL）对峰面积A进行回归，得阿达帕林标准曲线方程为A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），表明阿达帕林浓度在0.189～2.268μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

取“2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样测定6次。结果阿达帕林峰面积的RSD=0.82%。表明本方法测定阿达帕林的RSD值小于15%，在规定的范围内，说明本测定方法的重现性良好。

2.6 稳定性试验

由大学生对外卖服务的满意情况与对市场未来前景观点的交叉图（见图2）可以看出，随着调查对象满意程度的加强，他们对共享经济在未来发展趋势的乐观度也随之加强．

2.6.1 室温条件将12 h样品接收液于室温下存放24 h，分别于0、4、6、8、12、24 h量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，考察透皮接收液在室温条件下存放的稳定性，记录结果：平均峰面积为0.843 7，RSD为1.41%。结果表明：透皮接收液在室温条件下存放24 h内稳定。

2.6.2 冷藏（4℃）条件将12 h样品接收液于冷藏（4℃）条件下存放7 d，分别于第1、2、3、4、5天同一时间量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，考察透皮接收液在冷藏（4℃）条件下存放的稳定性，记录结果：平均峰面积为0.847 6，RSD为0.81%。结果表明：透皮接收液在冷藏（4℃）条件下存放5 d稳定。

2.7 回收率试验

精密量取“2.2”项下对照品储备液0.05、0.10、0.15 mL分别加入至空白接收液中，每种浓度各3份，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

低、中、高3种浓度回收率的平均值（99.93%）在85%～115%的范围内，表明本测定方法的准确度高。因此，笔者所选择的HPLC法适用于对阿达帕林透皮吸收的研究。

2.8 体外透皮实验[4]

2.8.1 体外皮肤的制备将巴马香猪用电动剪毛刀剪去腹部皮肤毛，12 h后处死，剥离皮肤（去毛部位），刮去皮下脂肪组织后用生理盐水冲洗干净，置于生理盐水中浸泡约30min，

取出，用滤纸吸干备用。为了尽量消除不同部位动物皮肤可能导致的误差。将每块皮肤随机分成两半，一半用于市售凝胶透皮，另一半用自制凝胶透皮。

2.8.2透皮扩散装置采用改进的Franz立体扩散装置，接受递质体积为14 mL，有效释药面积为4.7 cm2，（37±0.5）℃恒温，搅拌速度为300 r/min。

2.8.3 实验步骤将处理好的离体猪皮固定在于Franz立体扩散池上，角质层朝上，以皮肤恰好与液面接触为好，将阿达帕林凝胶（约0.5 g）均匀涂布在猪皮上，在接收池中加生理盐水14mL，用磁力搅拌器恒速搅拌接受液，使药物自然释放，保持恒温水浴。分别于涂布后0.5、1、2、4、6、8、12 h定时取接受液1 mL，取样后即向接受室内补充1mL生理盐水。用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液进样测定，按下列公式[5]计算单位面积累积渗透量（Qn）：

式中Vo为接收液总体积，V为取样量，qn为第n次实测单位面积渗透量（qn=样品峰面积×对照品浓度×接收液取样量/（对照品峰面积×释放面积），qi为第n次前每次测得的单位面积渗透量。各时间点药物单位面积累计渗透量见表1。以单位面积平均累积渗透量对时间进行线性回归，拟合所得直线斜率即透皮速率（J）[6]。

2.8.4 实验结果各时间点药物单位面积累计渗透量见表2；以单位面积累积渗透量对时间进行线性回归，所得直线斜率即透皮速率（J），结果见表3；对自制和市售两处方的平均累积渗透量进行统计分析，结果见表4。

表2 两处方的药物单位面积累积渗透量（μg）

表3 两种样品单位面积累积渗透量（Q）及透皮速率分析

表4 两种样品平均累积渗透量的方差分析

结果表明，我公司生产的阿达帕林凝胶与原研厂家生产的阿达帕林凝胶在相同的拟定试验条件下，2 h之前的透皮接收液均未检出阿达帕林；7个取样点的平均渗透量差异无统计学意义（P＞0.05），说明两者的安全性和有效性差异无统计学意义。阿达帕林的累积渗透量与渗透时间呈良好的线性关系，表明阿达帕林的经皮渗透符合一级动力学过程。

3 讨论

3.1 杂质对检测结果的影响

在体外皮肤渗透实验中，动物皮肤中的蛋白质的脱落或溶解不仅会污染接受液而且本身可能会有紫外吸收，在本研究中，波长270 nm处没有任何干扰主药测定的物质存在，因此，笔者采用检测灵敏度较高的的HPLC测定吸收液中的阿达帕林的含量，排除了干扰，得到了基线分离，保证了实验结果的准确。

3.2 接收液的处理

本实验采用改进的的Franz立体扩散装置考察阿达帕林凝胶体外透皮量，操作简便，重复性好。为防止由于猪皮中蛋白质和脂质等大量生物大分子在接收液中溶出影响检测结果、污染色谱柱，因此在进行HPLC检测之前必须对接收液进行过滤。

3.3 试验皮肤的选择

研究药物的透皮吸收最理想的方法是对人体做实际的研究。但人体皮肤难以获得，且价格昂贵，因而应用动物皮肤进行透皮吸收研究具有实际意义。据报道猪与人的皮肤组织结构很相似，上皮修复再生，皮下脂肪层也相似，而且实验证明2～3月龄的小猪皮肤解剖生理特点最接近于人[7]，所以选择小猪皮肤作为透皮吸收研究模型是较理想的实验动物模型。

3.4 自制阿达帕林凝胶的透皮性能

接受液中阿达帕林的含量测定结果表明，阿达帕林的累积渗透量随时间的延长而增加，以Q对t进行线性回归，说明其累积渗透量Q与t线性相关性较好。由测定结果可以看出，自制和市售凝胶的相关系数、透皮速率及12 h累积渗透量均非常平行，具有可比性。两者的平均累积渗透量的方差分析结果显示它们的平均累积渗透量差异无统计学意义（P> 0.05），即两者透皮现象基本一致，表明两者的治疗效果相当。

[1]刘磊，张玉萍.阿达帕林凝胶治疗轻、中度痤疮疗效观察[J].中国实用医药，2006，1（4）：66-67.

[2]张锡宝，赵辨.阿达帕林（Adapalene）—治疗痤疮的新药[J].中华皮肤科杂志，1999，28（12）：132

[3]丁承瑛，陆莉萍，王祥发.促进剂对双氯芬酸贴片的透皮释放作用[J].中国医院药学杂志，1998，18（5）：216.

[4]朱晓亮，李国锋，曾抗，等.利多卡因纳米乳制备及体外经皮吸收的实验研究[J].南方医科大学学报，2010，30（3）：451-454.

[5]王晖，高丽丽，徐铭，等.磷酸川芎嗪的体外透皮吸收[J].中草药，2000，31（2）：117-119.

[6]翟光喜，王唯红，陈晓，等.雌二醇软膏体外透皮吸收的研究[J].山东医药工业，2001，20（6）：1-2.

[7]Bhatti AS，Scott RC.In-vitro percutaneos absorption：pig epidermal membrame as amoder for human skin[J].Pharm Pharmacol，1988，40（suppl）：45.

Determ ination of percutaneous absorption of Adapalene from Adapalene Gel by HPLC

XIAO Xuecheng CHEN Feng LIDan LIJin
College of Pharmacy,HubeiUniversity of Chinese Medicine,Hubei Province,Wuhan 430065,China

ObjectiveTo establish an HPLCmethod for quantitative determination of Adapalene in vitro percutaneous solution,and investigate the ability of percutaneous penetration of Adapalene Gel.MethodsGlobal C18column(250 mm× 4.6mm,5μm)was used as the fixed phase and amixture ofmethanol,purification water and tetrahydrofuran(86∶9∶5)as a mobile phase.The flow rate was 1.0mL/min.The detection wavelength was at 270 nm.Improved Franz type diffusion cells were used in vitro permeation studies and excised minipigs skins in vitro were used as transdermal barrier.The concentration of Adapalene in the receptor solution was determined by HPLC to investigate its cumulative permeation quantities at different time respectively and compared with that of the commercial gel.ResultsThe regression equation of Adapalene was linear in the range of 0.189-2.268μg/mL(A=1.031 88C-0.042 7,r=0.999 9).The average recovery was 99.93%.A good linear relationship existed betwen the cumulative penetration quantities and the time.There was no significant difference in the permeation quantities between the self-made and commercial gel.ConclusionThe method is simple,rapid, and accurate.It is a bettermethod to evaluate the characteristic of permeation for Adapalene.

Adapalene;Percutaneous absorption;HPLC

R927.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0120-03

2012-07-06 本文编辑：卫轲）