广西莪术及其茎叶多糖的体外纤溶活性研究

曾金强 潘小姣 陈秋燕 唐璐

1．广西边防总队医院，广西南宁 530022；2.广西中医药大学，广西南宁 530001

广西莪术及其茎叶多糖的体外纤溶活性研究

曾金强1潘小姣2陈秋燕2唐璐2

1．广西边防总队医院，广西南宁 530022；2.广西中医药大学，广西南宁 530001

目的考察广西莪术及其茎叶多糖的体外纤溶活性。方法用分步沉淀法，分离广西莪术及其茎叶的多糖，然后用纤维蛋白琼脂平板法考察不同醇沉多糖的纤溶活性。结果广西莪术只有10%醇浓度沉淀多糖的体外纤溶效果稳定。广西莪术茎叶10%～30%的醇浓度沉淀多糖体外纤溶作用稳定，40%～60%的醇浓度沉淀多糖在高、中浓度时作用稳定，在低浓度时作用不稳定；在有纤溶活性的分步沉淀多糖中，除了10%和30%的醇浓度沉淀多糖具有浓度依赖性之外（P＜0.05），其余纤溶活性多糖均无浓度依赖性。结论广西莪术及其茎叶的多糖成分具有体外纤溶活性。

广西莪术；纤溶活性；多糖

莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术Curcum a phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，其性味辛、苦、温，归肝、脾经，具行气破血、消积止痛的功效，用于症瘕痞块，瘀血经闭，胸痹心痛，食积胀痛[1]。其中的广西莪术主要分布于我国的广西壮族自治区，又称毛莪术、桂莪术，主要含有挥发油、姜黄素、二苯庚烷类、多种萜类及多糖类等成分[2-3]。现代药理研究表明，莪术具有抗肿瘤、抗菌、抗血栓等广泛的药理活性，但是目前大多数研究对象都是局限于莪术的醇、水提取液或者挥发油[4-6]，对莪术多糖的药理研究较少，目前尚无莪术多糖纤溶方面的研究报道。莪术茎叶一般被认为不具有药用价值，目前尚无药效方面的研究报道。笔者在前期研究工作中发现桂郁金（来源为姜科姜黄属植物广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F. Liang干燥的块根）多糖具有明显的体外纤溶作用，广西莪术及其茎叶和桂郁金来源于相同植物的不同部位，故推测广西莪术及其茎叶也可能具有纤溶活性的多糖。本文采用纤维蛋白琼脂平板法，对广西莪术及其茎叶的多糖进行体外纤溶活性研究，现将研究报道如下：

1 仪器与试药

1.1 药材

广西莪术（生品阴干）及其茎叶（干燥地上部位），均产自广西灵山，两者经广西中医药大学梁子宁副教授鉴定为姜科姜黄属植物广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F. Liang的根茎及其茎叶。

1.2 试剂

琼脂（上海国药集团），尿激酶（纯度：85%，批号：39784，Aladdin Chemistry Co.Ltd），纤维蛋白原（纯度：75%，批号：029K7636V，Sigma，北京拜尔迪生物技术有限公司分装），凝血酶（纯度：75%，批号：070M7351V，Sigma，北京拜尔迪生物技术有限公司分装），磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.4，博海生物科技有限公司），乙醇为分析纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

移液枪（Dragon-med），90 mm玻璃培养皿（上海申玻仪器公司），游标卡尺（上海恒胜工具有限公司），B3500S-MT超声清洗仪（上海必能信超声有限公司），LRH-100生物培养箱（广东泰宏医疗器械有限公司），80-2医用离心机（金坛市医疗仪器厂）。

表1 广西莪术分步沉淀多糖的体外纤溶活性结果（n=3）

2 方法与结果

2.1 分步醇沉法提取分离广西莪术及其茎叶的多糖

取广西莪术和其茎叶粉末各5 g，分别加50mL和80mL纯水，超声提取1 h，过滤，将滤液分别水浴浓缩至12 mL，取2mL浓缩液继续水浴蒸干得到水提液浸膏，剩下10 mL浓缩液分别加入适量无水乙醇调节含醇量为10%，置冰箱5℃冷藏至少5 h以上，离心5min（10 000 r/min），分取多糖沉淀和上清液，多糖沉淀于45℃低温干燥之后置冰箱冷冻保存，剩下的上清液再加入适量无水乙醇调节含醇量为20%，同法制备20%的醇沉多糖，然后依次同法制备得到30%～90%的醇沉多糖。将90%醇沉多糖的乙醇上清液水浴蒸干，得到上清夜浸膏。将水提液浸膏、各段醇沉多糖和乙醇上清液分别加水制成浓度为24、12和6mg/mL三个浓度的样品，备用。

表2 广西莪术茎叶分段沉淀多糖的体外纤溶活性结果（±s，n=3）

表2 广西莪术茎叶分段沉淀多糖的体外纤溶活性结果（±s，n=3）

注：“±”表示纤溶作用不稳定，时有时无；“－”表示没有纤溶作用；“★”表示该组样品不同浓度之间的纤溶活性差异显著，P＜0.05；“*”表示由于2 mL提取液的浸膏重0.271 2 g，故推算出12mL提取液的浸膏重1.627 2 g，进而推算出5 g莪术的浸膏提取率约为32.54%

样品重量（mg）得率（%）浓度（mg/mL）加样量（μL）透明圈直径（±s，mm）茎叶超声水提液★1 627.2 32.54茎叶10%醇沉多糖★16.75.76茎叶20%醇沉多糖8.73.00茎叶30%醇沉多糖★8.83.04茎叶40%醇沉多糖21.17.28茎叶50%醇沉多糖34.411.87茎叶60%醇沉多糖31.610.91 23.05±1.93 20.87±1.80 18.25±2.33 21.08±2.68 19.27±2.02 17.07±2.54 20.66±4.37 16.71±2.18 16.65±5.18 20.30±6.15 19.22±4.67 15.79±3.20 19.72±5.59 19.57±4.63 ± 18.15±3.76 18.30±4.59 ± 16.66±3.75 17.65±3.89茎叶70%醇沉多糖26.79.22茎叶80%醇沉多糖34.912.05茎叶90%醇沉多糖14.85.11 90%乙醇上清液92.031.76 ±±±±－－－－－－－－－尿激酶★24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 100.00 U/mL 50.00 U/mL 25.00 U/mL 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 14.85±0.97 13.71±0.77 12.57±0.86

2.2 储备溶液的配置

用PBS缓冲溶液分别配制10 mg/mL的纤维蛋白原溶液、1 U/mL的凝血酶和100 U/mL的尿激酶，小剂量分装后于-20℃保存，临用前取出适量解冻后使用。

2.3 每个纤维蛋白琼脂平板的制备

取0.2 g琼脂加适量PBS缓冲液加热溶解，最后用PBS缓冲液定容成20mL。待温度降到55～60℃时，取18mL放入玻璃杯中，先加入解冻至30℃的纤维蛋白原溶液（10mg/mL） 1 mL，摇匀之后再加入解冻至30℃的凝血酶溶液（1 U/mL）1 mL，摇匀，立即倒入水平放置的90 mm玻璃培养皿中，待冷凝之后打孔。

2.4 样品的加入和结果的测量

2.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.6 结果

实验结果表明广西莪术只有10%醇浓度沉淀多糖的体外纤溶效果稳定。广西莪术茎叶10%～30%的醇浓度沉淀多糖体外纤溶作用稳定，40%～60%的醇浓度沉淀多糖在高、中浓度时作用稳定，在低浓度时作用不稳定；在有纤溶活性的分步沉淀多糖中，除了10%和30%的醇浓度沉淀多糖具有浓度依赖性之外（P＜0.05），其余纤溶活性多糖的均无浓度依赖性。见表1、2。

3 讨论

纤维蛋白平板法是目前最常用的溶栓活性体外检测方法，其实验原理为：纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转化成纤维蛋白（形成血栓的主要结构），而当药物将纤维蛋白溶解，就会产生纤溶圈，通过产生纤溶圈的大小可以推断药物具有纤溶活性能力的大小[7]。纤维蛋白原、凝血酶和尿激酶的化学性质很不稳定，配成溶液之后最好小剂量分装冷冻保存，每次根据实验所需取出适量解冻，如果反复地冻溶将使其失去活性。

用分步醇沉的方法分离多糖时，不同浓度醇沉多糖的相对分子质量（Mr）分布不同[8]。10%～30%醇浓度沉淀出的应是一些高Mr的多糖，40%～60%醇浓度沉淀出的应是一些中等Mr的多糖，70%～90%醇浓度沉淀出的应是一些低Mr的多糖。广西莪术只有10%醇沉多糖具有稳定的体外纤溶活性，故推测其具有活性的应该是一些高Mr的多糖，但是通过碘液检测实验发现在该活性多糖中含有大量淀粉，所以虽然该段多糖的得率较高（24.70%），但是因为其含有不具药效的高Mr多糖（淀粉），所以其真正的纤溶活性多糖的含量应该不高。广西莪术茎叶10%～60%的醇沉多糖都有较明显的体外纤溶活性，该部分醇沉多糖的得率较高，合计约为40%，且通过用碘液检测发现其所有的活性多糖均不含淀粉。由此可见，广西莪术茎叶中含有较多的高至中等Mr的体外纤溶活性多糖，而且不含淀粉，可以在用醇沉的方法分离多糖的过程中避免淀粉的干扰，因此广西莪术茎叶在抗血栓方面更具有开发的潜在价值。

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Vitro fibrinolytic activities of polysaccharides from Rhizome and stem and its leaf of Curcuma kwangsiensis

ZENG Jinqiang1 PAN Xiaojiao2 CHEN Qiuyan2 TANG Lu2
1.Guangxi Frontier Corps Hospital,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530022,China;2.University of Guangxi Traditional Chinese Medical,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530001,China

ObjectiveTo observe the vitro fibrinolytic activities of polysaccharides from Rhizome and its stem and leaf of Curcuma kwangsiensis.MethodsFractional precipitation was used to separate the different polysaccharides and fibrin plate method was used to detect their vitro fibrinolytic activities.ResultsOnly the 10%alcohol precipitated polysaccharides from Rhizome of Curcuma kwangsiensis had stable vitro fibrinolytic activities.The polysaccharides having stable vitro fibrinolytic activities from stem and leaf of Curcuma kwangsiensis were the 10%to 30%alcohol precipitated polysaccharides and the high and medium concetration of 40%to 60%alcohol precipitated polysaccharides.10%and 30%alcohol precipitated polysaccharides had vitro fibrinolytic activities in concentration-dependentmanner(P＜0.05).Other fibrinolytic activities polysaccharides had no concentra-tion-dependent.ConclusionPolysaccharides from rhizome,stem and leaf of Curcuma kwangsiensis has vitro fibrinolytic activities.

Curcuma kwangsiensis;Fibrinolytic activities;Polysaccharides

R972.5

A

1673-7210（2012）11（c）-0022-03

国家自然科学基金项目（项目编号：200810LX100）；2011年度广西高等学校科研资助项目（项目编号：200103YB081）。

曾金强（1972-），男，副主任医师，主要从事活血化瘀中药治疗疼痛症及心血管疾病的研究。

潘小姣（1975-），女，硕士研究生，副教授，主要从事中药活性成分筛选及其质量标准研究。

2012-07-20 本文编辑：卫轲）