CD157在RPE细胞中的表达及对细胞迁移、黏附的影响△

李 印 李 拓 宋秀胜 李家璋 吴青松 李红艳 贺 涛

CD157是一种相对分子质量为42 000～45 000的细胞膜表面分子，通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)锚着于细胞膜上，称为GPI锚定蛋白，它们没有跨膜区与胞内部分，不能直接与胞内发生联系。但用特异性抗体与这些结构上不同的膜蛋白或膜糖鞘脂结合后，却能诱导细胞内信号转导和细胞产生应答反应，介导细胞的黏附和迁移及参与免疫反应的调节[1]。虽然CD157没有跨膜结构，但具有受体功能，向细胞内传递信号，这个功能可用抗CD157的单克隆抗体作为天然配体进行实验[2]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的主要细胞成分，RPE细胞的迁移、黏附和增生是PVR形成的最重要的机制。许多眼科疾病的发生都与RPE细胞的迁移、黏附有关。为研究RPE细胞的迁移和黏附作用是否与CD157有关，我们采用免疫组织化学、Western-blot、RT-PCR检测ARPE-19细胞中CD157的表达，并用CD157单克隆抗体刺激细胞，检测其对细胞的迁移和黏附功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 ARPE-19细胞系、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(武汉大学细胞库，CCTCC)，DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(加拿大Fermentas公司)，PCR扩增试剂(加拿大Fermentas公司)，RIPA细胞裂解液(北京普利莱基因技术公司)，CD157鼠抗人单克隆抗体(SY/11B5)(美国eBioscience公司)，βactin鼠抗(武汉博士德生物工程有限公司)，人纤连蛋白(fibronectin，FN)(以色列，Prospec公司)，山羊抗鼠SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 将无菌的盖玻片置入培养板中，将ARPE-19细胞接种于盖玻片上，置于37℃、含体积分数5%CO2培养箱培养过夜。捞出盖玻片，PBS漂洗，冰丙酮固定15 min，晾干，体积分数3%H2O2室温孵育15 min，PBS清洗，吸去 PBS，在玻片上滴加50 g·L－1BSA，室温封闭30 min，实验组滴加1∶100稀释的鼠抗人CD157一抗并放入湿盒，阴性对照组滴加鼠血清IgG，4℃孵育过夜;滴加生物素化二抗(羊抗鼠)37℃孵育25 min，PBS冲洗，滴加SABC复合物，37℃孵育25 min。每张爬片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜(Nikon E100)下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色染色。

1.2.2 Western-blot检测细胞中 CD157 蛋白的表达 取培养的ARPE-19细胞(实验组)及HUVEC(阳性对照组)，弃培养液，PBS洗涤后加RIPA细胞裂解液刮取细胞，并超声裂解，蛋白定量，120 g·L－1SDS-PAGE蛋白电泳，转膜，50 g·L－1脱脂奶粉的封闭液室温摇床封闭2 h，1∶500稀释的一抗孵育液浸泡PVDF膜，4℃孵育过夜，1∶20 000稀释羊抗鼠HRP二抗孵育，室温摇床孵育2 h，发光试剂盒(ECL)发光，曝片。

1.2.3 RT-PCR检测细胞中CD157 mRNA的表达采用Trizol试剂提取ARPE-19细胞总RNA，实验步骤按说明书进行，取2 μg总RNA用Oligo-dT引物扩增cDNA文库，取2 μL cDNA产物做逆转录 PCR反应模板。CD157引物(上游引物:5’-CGATTACCAATCCTGCCCTA-3’，下游引物:5’-TTTGATGGGATAGGCTCCTG-3’，154 bp)、β-actin 引物(上游引物:5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物:5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，240 bp)。总量25 μL的PCR反应体系如下:10 ×PCR缓冲液 2.5 μL，25 μmol·L－1MgCl21.5 μL，2.5 μmol·L－1dNTP 2.0 μL，Taq 酶0.5 μL，上下游引物(10 μmol·L－1)各 0.5 μL，剩余用水补足。反应条件为:94℃预变性4 min，开始循环:94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s，共30个循环，最后72℃延伸4 min。PCR产物及PCR-Marker在含溴化乙锭(EB)的10 g·L－1琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯上观察并照相，β-actin作为内对照。

1.3 CD157对RPE细胞迁移及黏附的影响

1.3.1 Transwell小室检测细胞迁移能力 细胞用含体积分数1%FBS的DMEM/F12重悬，计数。取ARPE-19细胞(每孔50×103个细胞)分别加入10 mg·L－1鼠抗人 CD157抗体(实验组)或 β-actin鼠抗(对照组)室温处理20 min。在Transwell小室的下层加入400 μL含体积分数10%FBS的 DMEM/F12培养基，然后盖上8 μm的微孔多聚碳酸酯滤膜，将处理后的细胞加入Transwell小室内，置37℃、含体积分数5%CO2培养箱培养18 h。取出Transwell小室，小心擦去内侧膜上的细胞，外侧细胞结晶紫染色，在显微镜下每张膜随机观察5个视野并计数，实验重复3次。

1.3.2 Transwell小室检测细胞黏附能力 细胞传代、计数，取100×103个 ARPE-19细胞分别加入CD157抗体(实验组)和β-actin鼠抗(对照组)，终浓度为10 mg·L－1，室温处理20 min后种植于FN(10 mg·L－1)包被的24孔板中，置37℃、含体积分数5%CO2温箱孵育1 h后PBS冲洗掉未被黏附的细胞，黏附的细胞用40 g·L－1多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下每孔任选5个视野计数。实验重复3次。

1.4 统计学处理 本研究采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，实验中计量资料用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD157在RPE细胞中的表达 通过免疫组织化学结果显示:实验组ARPE-19细胞表面有着色，胞核及胞质中未见显色(图1)，阴性对照组细胞表面及胞质、胞核均未见着色(图2)。Western-blot检测ARPE-19细胞(实验组)及HUVEC/CD157+(阳性对照组)中均有CD157表达(图3)，RT-PCR也可证实RPE细胞中有CD157的表达(图4)。

2.2 CD157抑制ARPE-19细胞的迁移 对照组和实验组迁移细胞数见表1，两组比较差异有统计学意义(t=11.759，P ＜0.05)，表明CD157 可抑制 ARPE-19细胞的迁移。

Figure 1 Immunohistochemistry showed the surface of ARPE-19 cells was dyed，but no dyed in nucleus or cytoplasm in experiment group(×400) 实验组ARPE-19细胞表面有着色，胞核及胞质中未见显色(×400)

Figure 2 Cells surface，cytoplasm and nuclei was not stained in negative control group(×400) 阴性对照组细胞表面及胞质、胞核均未见着色(×400)

Figure 3 CD157 expression was detected by Western-blot both in ARPE-19 cell(experiment group)and HUVEC(positive control group)Western-blot检测ARPE-19细胞(实验组)及HUVEC/CD157+(阳性对照组)中均有CD157表达

表1 实验组和对照组迁移细胞数比较Table 1 Comparison of migrative cells between experimental group and control group(±s)

表1 实验组和对照组迁移细胞数比较Table 1 Comparison of migrative cells between experimental group and control group(±s)

Group Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 203±36 219±42 225±37 Control 384±46 357±38 362±57

2.3 CD157抑制 RPE细胞的黏附 实验组(CD157抗体)与对照组(β-actin鼠抗)黏附的细胞数见表2，2组比较差异有统计学意义(t=14.370，P＜0.05)。表明CD157具有抑制RPE细胞黏附的功能。

Figure 4 RT-PCR showed CD157(154 bp)expression RT-PCR结果显示CD157(154 bp)表达

表2 实验组和对照组黏附细胞数比较Table 2 Comparison of adhesive cells between experimental group and control group(±s)

表2 实验组和对照组黏附细胞数比较Table 2 Comparison of adhesive cells between experimental group and control group(±s)

Group Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 222±20 243±34 237±26 Control 330±56 353±44 347±38

3 讨论

人类CD157又名为骨髓基质细胞抗原 (bone marrow stromal cell antigen 1，BST-1)或髓系抗原Mo5，是一个含有318个氨基酸信号序列的单链细胞表面糖蛋白，人类与鼠的CD157分子氨基酸序列有72%的一致性[3]。作为一种GPI锚定蛋白，COOH-端是主要锚着位点。CD157的氨基酸序列完全位于细胞外而无任何跨膜区或胞内部分，接近细胞膜表面的COOH-端为疏水区，末梢部的NH2-端含有催化域[4]。CD157同时具有ADP核糖基环化酶、cADPR水解酶两种胞外酶(次要作用)和细胞表面受体功能(主要作用)的双重特性。作为胞外酶，CD157属于CD38分子家族，其在蛋白构成上有36%的氨基酸序列一致性，但是CD157和CD38的组织分布截然不同，可表达于骨髓基质细胞、间皮细胞、脐静脉内皮细胞等多种类型的细胞上，但不表达在脑组织中[5]。其表达在角膜缘干细胞和角膜基质细胞上可发挥受体作用的功能[6]。类风湿关节炎的关节腔滑液中也有CD157的表达，并被认为是类风湿性关节炎的致病因子[7]。CD157在卵巢癌细胞的黏附、迁移及向腹膜侵袭过程中起着不可或缺的作用[8]。参与调节体液免疫反应[9]及白血球聚集[10]，是中性粒细胞黏附和跨内皮细胞迁移中起关键作用的分子[11-12]。

目前，尚无文献研究CD157在RPE细胞中的作用，为了解在RPE细胞中有无CD157的表达及其作用，本实验免疫组织化学结果显示:ARPE-19细胞表面有显色，而胞核与胞质均无着色，提示细胞表面有CD157的表达;Western-blot结果提示ARPE-19细胞中有CD157蛋白的表达;RT-PCR也证实了ARPE-19细胞有CD157的转录。以上各方法均能证实ARPE-19细胞中有CD157的表达，并通过进一步实验研究CD157在RPE细胞中的作用。RPE细胞的移行被认为是 PVR等疾病发生的重要起始阶段。RPE从原位游离出来，离开原有的微环境后，形态和功能上发生了很大变化，细胞开始失去它原来的形态学特点，由静止状态转变为活跃状态，当接触到网状的玻璃体纤维或到达视网膜表面时开始增生，合成细胞外基质。由整合素介导的RPE细胞与细胞外基质蛋白以及RPE细胞之间的黏附则涉及PVR的形成[13]。而CD157可募集整合素等跨膜分子形成大分子复合物，构成分子搭档参与信号转导及迁移和黏附功能[14]。

目前，对某一细胞受体或表面分子在其自然配体未找到之前，均用其特导抗体结合该分子以模拟配体、受体之间的结合，来研究其介导的信号转导或功能，但这种方式在何种程度上真正模拟了配体、受体之间的自然结合并不清楚。根据Funaro等[12]和Lo Buono等[14]对CD157的相关研究，我们发现用10 mg·L－1CD157单克隆抗体处理ARPE-19细胞20 min后，细胞的迁移和黏附能力明显减弱，说明CD157可抑制ARPE-19细胞的迁移和黏附，但是与对照组相比，并没有因为刺激了CD157后彻底降低，提示在ARPE-19细胞的迁移和黏附过程中，CD157的表达起部分作用或与某些分子起着联合作用，但还存在其他的未知因素起部分作用，需要进一步研究。

CD157是一种锚定蛋白，位于胞外而无跨膜区或胞内结构介导信号转导，需借助与其结合的相关分子(自然配体、特异抗体等)帮助胞外信号向胞内转导。本实验结果表明CD157的表达是ARPE-19细胞迁移、黏附的主要机制之一，可能在PVR发生发展中起着不可或缺的作用。但其信号转导通路仍待继续研究。

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