兔LASIK术后角膜瓣弃留与紫外线照射对角膜上皮下雾状混浊影响的实验研究△

彭志优 周 琼 邵 毅 刘永琰 李汉林

LASIK是目前广泛应用于临床的准分子激光屈光性角膜手术，术中一般的角膜瓣厚为130～160 μm，包括上皮层、前弹力层及部分角膜基质。在LASIK术后遇到外伤或眼部其他手术时角膜瓣部分甚至整个丢失的情况时有发生，角膜瓣丢失后由角膜上皮细胞覆盖修复，但容易出现角膜上皮下雾状混浊(Haze)。研究Haze出现的原因，可为临床屈光手术后防止Haze形成提供实验依据。

紫外线对角膜的损害具有剂量依赖性，急性大剂量暴露于紫外线的角膜易产生水肿和上皮、基质粒状混浊等改变，类似于慢性暴露于富有紫外线的地区时角膜的改变。故本实验一次大剂量使用紫外线对角膜进行照射，以研究其对角膜的损伤，进一步了解LASIK术后紫外线对Haze的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 新西兰大耳白兔36只(由南昌大学医学院动物实验部提供)，兔龄3个月，随机分为保留角膜瓣行紫外线照射组(Ⅰa组)、不保留角膜瓣行紫外线照射组(Ⅰb组)、正常角膜行紫外线照射组(Ⅰc组)、保留角膜瓣未行紫外线照射组(Ⅱa组)、不保留角膜瓣未行紫外线照射组(Ⅱb组)及正常角膜无紫外线照射组(Ⅱc组)6组，每组6只兔12眼。

1.2 动物模型的建立 LASIK角膜瓣手术模型眼的建立:取Ⅰa组、Ⅰb组、Ⅱa组及Ⅱb组共24只兔，双眼按LASIK术式制作角膜瓣。经腹腔注射30 g·L－1戊巴比妥钠(30 mg·kg－1)全身麻醉后，做7.5 mm带蒂角膜瓣，弧度约30°，其中Ⅰa组及Ⅱa组角膜瓣复位，Ⅰb组及Ⅱb组在制作角膜瓣后即刻人为去除双眼角膜瓣。术毕滴泰利必妥眼液，裂隙灯检查并照相。紫外线照射模型眼的建立:术后1周，Ⅰa组、Ⅰb组及Ⅰc组共18只兔双眼行紫外线照射 7 min(100 mJ·cm－2，UV-B 灯照射)[1]。

1.3 观察记录

1.3.1 裂隙灯检查 角膜瓣制作术后第1周内每天和术后第2周、第3周、第4周及第5周在裂隙灯显微镜下行角膜及Haze等情况的观察，角膜Haze标准按照Fantes法[2]分5级:0级:经裂隙灯显微镜检查，角膜完全透明;0.5级:在裂隙灯显微镜下用斜照法才能发现轻度点状混浊;1级:在裂隙灯显微镜下容易发现角膜混浊，但不影响观察虹膜纹理;2级:角膜混浊，轻度影响观察虹膜纹理;3级:角膜明显混浊，中度影响观察虹膜纹理;4级:角膜严重混浊，不能窥见虹膜。观察并记录LASIK术后Ⅰa组、Ⅱa组、Ⅰb组及Ⅱb组的角膜上皮愈合时间和角膜基质水肿情况，以及Ⅰ组紫外线照射后角膜的反应。

1.3.2 组织学检查 术后第3周及第5周每组随机取3只兔，全身麻醉后用环钻取下双眼中央9 mm的全层角膜片，将取下的角膜片垂直分为两半，一半经体积分数10.0%甲醛固定后行光镜观察，另一半投入体积分数2.5%戊二醛固定液中固定后用于透射电镜检查。

1.4 统计学处理 所有数据采用SPSS 12.0统计软件处理，角膜上皮愈合时间用单因素方差分析进行总体均数的显著性检验，角膜Haze等级构成比采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裂隙灯检查 Ⅰa组及Ⅱa组术后第1天角膜上皮愈合，未见明显水肿及混浊。Ⅰb组及Ⅱb组角膜上皮愈合时间为2～3 d，角膜基质水肿明显，但1周内水肿完全消退。术后Ⅰa组、Ⅱa组、Ⅰb组、Ⅱb组角膜上皮愈合时间分别为(0.658 3±0.137 9)d、(0.741 7 ± 0.183 2)d、(2.966 7 ± 0.499 7)d、(2.816 7±0.415 2)d，经统计学处理，Ⅰa组与Ⅱa组、Ⅰb组与Ⅱb组之间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，Ⅰa组与Ⅰb组、Ⅰa组与Ⅱb组、Ⅱa组与Ⅰb组及Ⅱa组与Ⅱb组之间差异均有统计学意义(均为 P ＜0.05)。

术后1周，Ⅰb组及Ⅱb组兔眼皆有Haze发生，且随时间逐渐加重，Haze程度为1～2级，发生部位位于瓣丢失区角膜上皮下基质浅层。术后5周Ⅰb组及Ⅱb组裂隙灯显微镜下观察结果见图1。术后3周及5周各组Haze情况见表1。经卡方检验，术后3周及术后5周Ⅰb组及Ⅱb组与其他各组比较，Haze分级间差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，且Ⅰb组较Ⅱb组Haze重，差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅰa组 、Ⅱa组、Ⅰc组及Ⅱc组角膜透明，无Haze发生。

2.2 光镜检查 术后3周，Ⅰc组及Ⅱc组:角膜上皮及基底膜完整，浅层基质纤维细胞无异常改变;Ⅰa组及Ⅱa组:与正常角膜相比无明显组织形态学变化，仅角膜瓣与切削区基质浅层早期存在空隙;Ⅱb组:瓣丢失区角膜上皮细胞增为5～7层，上皮细胞排列紊乱、连接稍疏松，少数细胞空泡样变，上皮层和基质层间存在散在裂隙，基底细胞肿胀，可见空泡，基底膜不连续，厚薄不均匀，排列紊乱的角膜细胞较正常增多，成纤维细胞数量增多，形态及排列不规则;Ⅰb组:与Ⅱb组情况相近但增生更为明显，角膜上皮细胞为6～8层，排列紊乱的角膜细胞较多，成纤维细胞数量增多，细胞体积增大，排列不规则更为明显。

术后5周，Ⅰc组、Ⅱc组(图2A)、Ⅰa组及Ⅱa组:与正常标本形态一致;Ⅰb组:瓣丢失区角膜上皮细胞增为7～9层，角膜细胞增多、排列紊乱较3周时同组标本更加明显，成纤维细胞数量增多，排列不规则，瘢痕样改变明显(图2B);Ⅱb组:瓣丢失区角膜上皮细胞增为7～8层，上皮层和基质层间仍存在散在裂隙，基底细胞肿胀，可见空泡，基底膜不连续，厚薄不均匀，成纤维细胞数量增多，形态及排列不规则，仍可见较多的活性角膜细胞(图2C)。

Figure 1 Observation results under slit lamp microscope at postoperative 5 weeks in group Ⅰ b and Ⅱ b.A:Haze in groupⅠ b with grade 2;B:Haze in groupⅡb with grade 1 术后5周Ⅰb及Ⅱb组裂隙灯显微镜下观察结果。A:Ⅰb组角膜Haze 2级;B:Ⅱb组角膜Haze 1级

表1 术后3周及5周各组Haze情况Table 1 Corneal haze of each group at postoperative 3 weeks and 5 weeks

2.3 透射电镜检查 术后3周，Ⅰc组、Ⅱc组(图3A)、Ⅰa组及Ⅱa组:电镜下可见角膜上皮与基底膜及基底膜与基质结合紧密，桥粒及半桥粒致密、清晰，角膜细胞呈静止状态，基质胶原纤维排列整齐;Ⅰb组:角膜上皮细胞中含空泡，半桥粒稀疏，上皮基底膜厚薄不均匀，部分消失，且均比Ⅱb组更为明显，可见少许基底细胞及成纤维细胞有较活跃的核分裂相，部分角膜细胞内线粒体增多及扩大，成纤维细胞内质网增多，增生活跃(图3B);Ⅱb组:上皮基底细胞的半桥粒稀疏、基底膜不连续、厚薄不均匀，基质浅层胶原纤维排列紊乱，胶原纤维之间间隔不规则，成纤维细胞极度活化，数量增多，胞质内粗面内质网、高尔基复合体及线粒体增多，提示处于增殖状态(图3C)。

术后5周，Ⅰc组、Ⅱc组、Ⅰa组及Ⅱa组:与正常标本形态一致。Ⅰb组:与2周前同组标本情况类似，均表现为角膜上皮细胞间隙增宽、半桥粒稀疏、上皮基底膜厚薄不均匀等，但本周程度更重，增生更为明显(图3D);Ⅱb组:上皮基底细胞的半桥粒稀疏、基底膜不连续、厚薄不均，基质浅层胶原纤维排列紊乱较2周前同组标本更加明显，成纤维细胞数量增多，胞质内细胞器增多，仍处于增殖状态(图3E)。

Figure 3 Results under transmission electron microscope.A:Postoperative 3 weeks in groupⅡc;B:Postoperative 3 weeks in groupⅠb;C:Postoperative 3 weeks in groupⅡb;D:Postoperative 5 weeks in groupⅠb;E:Postoperative 5 weeks in groupⅡb 角膜透射电镜下观察结果。A:术后3周Ⅱc组;B:术后3周Ⅰb组;C:术后3周Ⅱb组;D:术后5周Ⅰb组;E:术后5周Ⅱb组

3 讨论

3.1 角膜Haze的形成原因 本实验中，Ⅰb组及Ⅱb组术后1周即出现1～2级Haze，且随时间逐渐加重。对Ⅰb组及Ⅱb组标本进行光镜及电镜观察表明，Haze的发生与瓣丢失后角膜组织的修复有直接关系。光镜下的观察结果显示，Ⅰb组及Ⅱb组Haze形成标本中角膜浅基质层的成纤维细胞数量增多，排列不规则;电镜的结果显示Ⅰb组及Ⅱb组术后成纤维细胞内具有丰富的细胞器，如大量的粗面内质网、高尔基复合体及线粒体等，均表明成纤维细胞具有活跃的合成功能。角膜组织修复过程中上述组织形态的改变与Haze的发生密切相关，是Haze形成的物质基础，且与Haze分级变化基本一致。

此外，根据本实验结果推测，Ⅰb组及Ⅱb组中Haze的发生与凋亡机制有关，Helena等[3]通过透射电镜及TUNEL技术均检测到兔模型眼仅制作角膜瓣而不进行激光消融可导致角膜细胞凋亡，损伤诱发的角膜细胞的凋亡是由受伤的上皮细胞释放凋亡前细胞因子介导的。本实验中，LASIK术中制作角膜瓣时角膜刀对周边上皮的切割能迅速启动切缘及其下方的角膜细胞的凋亡。细胞间信号传递的细胞因子提供了上皮与基质间相互作用的基础。凋亡的角膜细胞可在几天内由后层及周围的角膜细胞通过增生和迁移来代偿。活化的角膜细胞产生大量排列紊乱的胶原和其他成分。这与实验中所观察到的Ⅰb组及Ⅱb组上皮细胞增生到6～8层、基质层胶原排列紊乱、Haze形成相一致。

综上，角膜Haze的发生机制包括角膜创伤愈合机制和细胞凋亡机制。

3.2 角膜瓣丢失与Haze的形成及分级的关系 临床中曾有报道完整掀起过LASIK术后5 a的角膜瓣，这说明角膜瓣与基质床间的愈合程度虽然随时间的延长逐步加强，但二者并未牢固黏附[4]。当有较大的外力作用打断上皮间的连接时，就可能发生角膜瓣的丢失，从而影响视力。

临床上，LASIK术后角膜瓣丢失后Haze的发生率较角膜瓣完整者明显增高。因此本实验设计对兔眼按LASIK术式制作角膜瓣后人为丢失，探讨瓣丢失后角膜Haze的发生及角膜组织修复的过程。实验中观察到Ⅰb组及Ⅱb组角膜瓣丢失后虽然再生的角膜上皮很快将瓣丢失区基质层表面覆盖，但电镜观察显示术后3周半桥粒稀疏，且新合成的基底膜仍不连续。基底膜在角膜伤口愈合及形态重塑中起重要作用。层粘连蛋白是基底膜中主要的非胶原成分[5]，半桥粒的作用是将上皮细胞固定在基底膜上，角膜上皮的稳定性需要上皮细胞与其下的基底膜紧密贴附。兔角膜瓣丢失后，角膜结构的不完整与Haze的发生直接相关。

LASIK术中用显微角膜手术刀切割上皮可触发受损处周围的局部基质细胞凋亡，推测上皮层受损时释放介导凋亡的细胞因子:IL-1、角质细胞生长因子等，而角质细胞生长因子在上皮瓣完整时对基质伤口愈合的影响轻微。与Ⅰb组及Ⅱb组相比，Ⅰa组及Ⅱa组保留了角膜上皮及基底膜的完整性，其屏障作用使细胞因子介导的角膜上皮与基质的相互作用减小，角膜愈合反应轻，Haze发生率低[6]。另外，保留的角膜瓣类似于PRK术后移植羊膜的作用[7]，对泪液中的炎症因子及生长因子起了屏障作用，阻止了术后泪液中炎症细胞对瓣下基质区的侵蚀，减少了角膜前基质细胞的丢失，延缓了角膜上皮下成纤维细胞的增殖，故Ⅰa组及Ⅱa组术后Haze发生率较Ⅰb组及Ⅱb组低。此外，由于Ⅰa组及Ⅱa组保留了角膜上皮，使角膜上皮和角膜细胞之间的细胞因子传递仍呈正常状态，从而减少了Ⅲ型胶原的合成，因此，Ⅰa组及Ⅱa组与Ⅰb组及Ⅱb组相比表现出更轻微的愈合反应。

术后Ⅰa组及Ⅱa组Haze发生率低还与保留了角膜前弹力层有关，Bowman层的存在，可以明显减少激活的基质成纤维细胞过度增生及交错排列，使得基质细胞即使增生也是排列有序。杜之渝等[8]对Bowman层功能的研究表明，角膜基质无论是否行过激光切削，其前面只要无Bowman层存在，都会出现Haze。Obata等[9]推测 Bowman层可能是一个生物和生理屏障，可保持角膜内环境稳定，以防止上皮下纤维化和Haze的发生。在Ⅰa组及Ⅱa组，手术只是对Bowman层的环行切开，角膜瓣中仍保留完整的上皮层和前弹力层，使得Ⅰa组及Ⅱa组术后基本无Haze形成。

3.3 紫外线照射与Haze形成及分级的关系 本实验结果显示，同样存在角膜瓣的丢失，但Ⅰb组与Ⅱb组相比Haze分级更重，差异有统计学意义，其原因在于Ⅰb组于角膜瓣丢失后行紫外线照射。紫外线是一种非离子射线，角膜能吸收大部分UV-B辐射，且对UV-B引起的破坏很敏感。紫外线照射后角膜产生大量自由基，活性氧可通过各种途径诱导细胞凋亡。活性氧可以直接损伤DNA，攻击蛋白质，也可以通过影响基因转录、改变细胞的表型特征激发有关的调控基因，以诱导细胞发生凋亡。Eileen[10]指出，辐射诱导细胞凋亡存在着多种途径，是一个综合的生化反应过程。

紫外线致细胞凋亡已被大量实验所证明，而角膜细胞凋亡是角膜愈合反应的启动因素，凋亡角膜细胞数越多，活化角膜细胞数就越多，创伤反应越重。Ⅰb组与Ⅱb组同一时间段内电镜结果比较:Ⅰb组中角膜上皮细胞中含空泡、半桥粒稀疏、上皮基底膜厚薄不均匀等表现更为显著，具有较活跃核分裂相的基底细胞及成纤维细胞数量更多，出现角膜细胞内线粒体增多及扩大、成纤维细胞内大量内质网的频率更高，这些表现与Ⅰb组行紫外线照射有关。在裂隙灯下表现为Ⅰb组Haze的分级较Ⅱb组重。

3.4 角膜瓣丢失与紫外线照射同时存在对Haze形成及分级的影响 在角膜瓣丢失组(Ⅰb组及Ⅱb组)中紫外线照射对两组间Haze分级的影响具有统计学意义，而在保留角膜瓣组(Ⅰa组及Ⅱa组)中紫外线照射对两组间Haze分级的影响不具有统计学意义，其原因在于角膜瓣的丢失与否。丢失的角膜瓣含角膜上皮、前弹力层及浅层基质。Ringvold[11]对角膜上皮的研究表明:角膜上皮起紫外线过滤器作用，通过吸收大致低于310 nm的UV-B保护眼部结构，角膜上皮吸收UV-B主要归因于蛋白、RNA及抗坏血酸盐。前弹力层对于防止基质细胞过度无序增生、维持角膜的透明性起到十分重要的作用。前弹力层对紫外线的吸收系数几乎是基质的8倍，是有效的紫外线辐射过滤器。胶原排列及细胞外分子可能是前弹力层高吸收系数的原因。人类角膜前100 μm 对 UV-B 的吸收率是后面部分的1.8 倍[12]，故临床上角膜瓣丢失后，角膜组织对紫外线的破坏作用更加敏感，Haze的发生率更高。本实验光镜及电镜结果显示，术后5周Ⅰb组兔眼角膜上皮细胞间隙增宽、半桥粒稀疏、上皮基底膜厚薄不均匀。结构上的不完整降低了Ⅰb组角膜对紫外线的吸收率。所以术后1周行紫外线照射加重了Ⅰb组的细胞凋亡和创伤愈合反应，Haze分级更重。同一时间段内Ⅰb组Haze的分级重于Ⅱb组，这表明紫外线照射和角膜瓣丢失同时存在时细胞凋亡、角膜细胞活化及胶原增生更加显著，即紫外线能调节瓣丢失后角膜组织的创伤愈合反应。

综上可以看出，影响角膜Haze形成的因素是多方面的。兔角膜瓣丢失后角膜Haze的发生率为100%，表明角膜瓣的存在可以延缓角膜细胞凋亡，缩短上皮愈合时间，使伤口愈合反应迅速发生，但程度减轻，降低了Haze的发生率。紫外线照射后角膜Haze的增加表明紫外线照射加剧和延长了基质愈合反应。角膜瓣丢失和紫外线照射同时存在时，可加重创口愈合反应，增加Haze的发生率，加重Haze的分级。

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