大鼠眼钝挫伤后晶状体上皮细胞的凋亡及Survivin基因对凋亡的影响

刘建伟 赵桂秋 杜兆东 张丽娜 张振华

眼钝挫伤在临床上很常见，钝挫伤可导致多种眼部病变，而外伤性白内障是眼钝挫伤后最常见的并发症之一，它可以引起视功能的严重损伤[1]。外伤性白内障的发病机制目前还未明了。研究表明，晶状体上皮细胞的凋亡是除先天性白内障以外所有类型白内障形成的细胞学基础[2-3]。细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，机体通过细胞凋亡消除损伤、衰老与突变的细胞，当细胞凋亡异常(过高或过低)时，可导致各种疾病的发生。已知与细胞凋亡相关的基因或蛋白有很多，如Caspase家族[4]、c-fos基因[5]、Bcl-2 基因[6]等。Survivin 基因是一种凋亡抑制基因，具有很强的抑制肿瘤细胞凋亡的作用[7-8]。Survivin基因是否会对钝挫伤引起的细胞凋亡有影响呢?本文通过建立大鼠眼钝挫伤模型，研究钝挫伤后晶状体细胞凋亡和Survivin基因表达的特点，并找到两者之间的关联，为更好地认识外伤性白内障的发病机制提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物:健康成年Wistar大鼠45只(青岛市动物中心提供)，体质量200～250 g，雌雄兼有，实验前行裂隙灯显微镜检查无眼前节病变。所有动物的饲养及处死均按照美国国立卫生研究院(NIH)的《实验动物管理及使用指南》进行。(2)主要试剂及仪器:MK1020细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德工程有限公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德工程有限公司)，TRIZOL(Invitrigen life technologies公司)，RNA PCR KitVer.3.0(TaKaRa 公司)，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及分组 45只成年Wistar大鼠，随机选取5只作为正常对照组，剩余40只按照随机原则分为A组、B组、C组、D组，每组10只，100 g·L－1水合氯醛溶液(3 mL·kg－1)腹腔注射致全身麻醉后，用20 g钢球从20 cm高度落下连续击打大鼠一眼100次，制造眼钝挫伤模型。A组、B组、C组、D组大鼠分别于模型制备成功后1 h、12 h、24 h、48 h后颈椎脱臼法处死，取出晶状体，作细胞凋亡及RT-PCR检测。

1.2.2 晶状体上皮细胞凋亡的检测 采用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)原位检测晶状体上皮细胞的凋亡，镜下撕取部分晶状体前囊膜，剩余部分－70℃保存，备用作RT-PCR。晶状体前囊膜上皮面朝下，平铺到3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理过的载玻片上，40 g·L－1多聚甲醛固定30 min后，加标记缓冲液，终止后加入用抗体稀释液稀释的生物素化抗地高辛抗体及SABC，DAB显色。经上述处理后，凋亡细胞核被染成棕色或褐色，正常细胞核为蓝色。200倍显微镜下观察，随机选取5个视野计数。

1.2.3 Survivin基因表达的检测 采用RT-PCR逆转录聚合酶链反应半定量检测Survivin基因的表达。以大鼠5-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因序列作内参照物。应用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物由上海生工技术有限公司合成，引物序列如下:Survivin上游引物为 5’-CCCGATCTGGCAGATGTACCT-3’，下游引物为 5’-GGTCAGTTCTTCCACCTGCTTCT-3’，扩增片段长271 bp;GAPDH上游引物为5’-GGCTGCCTTCTCTTGTGACAA-3’，下游引物为5’-GGAAGATGGTGATGGGTTTCC-3’，扩增片段长173 bp。用TRIZOL提取组织总RNA，按照试剂盒步骤进行反转录及DNA的扩增。扩增产物电泳后用紫外线图像成像系统观察，并进行半定量分析，每份标本均观察到271 bp的Survivin扩增条带和173 bp的GAPDH基因特异性扩增条带，证实逆转录所得的cDNA完整以及PCR反应成功。反转录条件:42℃ 30 min，99℃ 5 min，0～4℃ 5 min。PCR条件:94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃(内参引物)或58℃(Survivin引物)30 s，72 ℃ 1.5 min，共28个循环，72 ℃终末延伸10 min。

1.3 凋亡率及Survivin mRNA相对含量测定 光镜下观察TUNEL染色标本，每个标本在200倍显微镜下随机选取5个视野，计数每个视野的全部细胞数和凋亡细胞数，计算凋亡细胞所占百分比即为晶状体上皮细胞凋亡率。将5 μL RNA用超纯水稀释至200 μL后，放入紫外分光光度计的比色杯中，测定260 nm、280 nm 处吸光度(optical density，OD)值，计算OD260/OD280的值为Survivin mRNA相对含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件，通过t检验对凋亡率进行分析，用Spearman法进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 凋亡特点 正常对照组及A组大鼠晶状体上皮中未见凋亡细胞。B组、C组、D组检测到凋亡细胞，3组凋亡率分别为(14.54 ±2.98)%、(41.54 ±6.07)%及(25.38±4.72)%，B 组与 C 组、C 组和 D组凋亡率比较，差异均具有统计学意义(t=9.19、6.64，均为P＜0.05)，说明凋亡高峰出现在钝挫伤后24 h(图1)。

Figure 1 LEC at 24 hours after eye contusion(×100) 大鼠眼钝挫伤后24 h晶状体上皮细胞(×100)

2.2 Survivin的表达 大鼠Survivin基因的PCR产物长度为271 bp，GAPDH的PCR产物长度为173 bp。正常对照组及A组大鼠晶状体上皮细胞未检测到Survivin的表达。B组、C组、D组均检测到Survivin的表达(图2)，相对表达量分别为:0.357±0.105、0.582 ±0.131 及0.386 ±0.143。

2.3 Survivin基因与凋亡的关系 B组、C组、D组中Survivin基因的表达量均与凋亡率呈显著负相关(r分别为 －0.795、－0.806、－0.832，均为 P ＜0.05)。

Figure 2 PCR electrophoresis photograph of GAPDH and group B，C，D.M:Mark;Line 1，2:GAPDH;3:Group B;4:Group C;5:Group D GAPDH 及B组、C组、D组PCR电泳图。M为Mark，1、2泳道为内参 GAPDH，3、4、5分别为 B 组、C 组、D组

3 讨论

细胞凋亡是细胞遵循自身固有程序结束生命的一种现象，具有独特的形态学特点及能量依赖的生化机制，对于维持组织生长、免疫调节、结构稳定等起到重要作用，凋亡功能一旦失调就会造成疾病的发生[9-10]。很多原因，如紫外线的照射[11]、重金属镉[12]、富勒醇[13]等都可以引起晶状体上皮细胞的病理性凋亡，从而导致白内障的发生。眼钝挫伤不仅可以直接冲击晶状体，引起晶状体上皮细胞的机械性损伤，还可以造成眼前节的急性炎症，产生一些炎症介质，改变房水的成分[14]，这些因素都可能影响到晶状体上皮细胞的代谢从而使其发生病理性凋亡。本实验通过钢球连续打击制造眼钝挫伤模型，结果表明，细胞凋亡在伤后12 h已经出现，说明钝挫伤发生后的较短时间内，凋亡程序就会启动。在钝挫伤发生24 h时，凋亡达到高峰，48 h时细胞的凋亡数量反而减少，这说明晶状体本身有阻止凋亡继续发生、维护正常生理结构的功能。当然，如果改变本实验模型中钝挫伤的强度、力度或者是致伤方式，凋亡的特点也有可能改变。

Survivin属于凋亡抑制蛋白家族中的一员，在大多数成年组织中不表达，但是在大多数肿瘤组织中表达，它能够抑制Caspases并阻止细胞凋亡，除了具有抑制凋亡、促进增生作用外，它还能够调控细胞周期[15-16]。本研究发现，正常的成年大鼠晶状体上皮细胞中未见Survivin的表达，用钢球打击后12 h可见有少量表达，24 h时表达最多。说明钝挫伤不仅可以引起凋亡的发生，同时可以刺激大鼠Survivin基因的表达，而且，随着钝挫伤发生时间的延长，细胞凋亡会经过自身的抗凋亡机制逐渐修复，Survivin基因的表达也逐渐减少，这提示我们Survivin基因可能在凋亡的发生、发展中起到了重要作用。

通过相关分析发现，B组、C组、D组晶状体上皮细胞的凋亡率与Survivin的表达量存在负相关，从而说明Survivin基因对眼钝挫伤引起的晶状体上皮细胞凋亡可能存在的抑制作用。然而，晶状体上皮细胞凋亡过程中，可能有很多的基因、蛋白参与，如果能采用基因静默的手段来阻止Survivin基因的表达，可能对结果的判断更有说服力。目前对Survivin的临床研究多集中在肿瘤治疗方面，而对通过增加Survivin表达来减少细胞凋亡的药物研究很少。王俊萍等[17]发现，丝裂霉素能诱导肝癌细胞表达Survivin基因，如果能够发掘到这一类药物，就可以用于很多像外伤性白内障一样因正常细胞凋亡过多而引起的疾病，从而为这类疾病的治疗提供新的手段。

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