实验性近视眼巩膜病理学与生物力学特性的改变

张 新 王超英 李 涛 陈维毅 郝 兰

巩膜在维持眼球形状方面起着重要作用，巩膜的生物力学特性对眼球的生理、病理状态都会产生影响。本实验通过建立哺乳动物豚鼠眼的近视模型，观测实验性近视眼巩膜的病理学改变及生物力学特性的变化，加深对近视眼的认识，为探讨近视眼的发病机制和指导临床防治工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组方法 选取2周龄已脱离母乳喂养的小豚鼠39只，雌雄不限，由河北医科大学实验动物养殖场提供，随机分为3组，A组(10 d)、B组(30 d)和C组(50 d)，每组豚鼠13只。制备凹透镜诱导性近视动物模型，每只动物均随机选择一眼为实验眼组，对侧眼为自身对照组。幼豚鼠于室内标准化喂养，白天用自然光照射，每天光照与黑暗的周期比例为14∶10，室温控制在20℃。

1.1.2 凹透镜片 自行设计的PMMA镜片，部分参数如下:镜片直径13.5 mm，光学直径10.5 mm，屈光度均为 －10.00 DS[1]。

1.2 实验方法

1.2.1 豚鼠凹透镜诱导性近视模型的建立 将豚鼠标记编号，带状光检影验光;全身麻醉后，用A超测量双眼球眼轴长度。测量以手动模式连续测量10次，计算平均值，精确到0.01 mm。将3组豚鼠分别喂养10 d、30 d、50 d后，摘出镜片，按前述方法再次行双眼睫状肌麻痹检影验光和A超测量眼轴。

1.2.2 取材及实验方法

1.2.2.1 取材 待上述测量结束后，处死动物，摘出双眼球，置于保存液中，进行生物力学实验时，将在液氮中保存的动物眼球取出后置37～38℃水浴中快速复温，解剖眼球制作巩膜试件(详细叙述见后)，将部分样本置于40 g·L－1多聚甲醛中固定以便进行组织学观察。随后制作常规HE染色病理切片，显微镜下观察。

1.2.2.2 生物力学实验方法

1.2.2.2.1 力学实验试件的制备及安装 实验时，将实验眼与对照眼球后极部巩膜剪成规则15.0 mm×3.2 mm的巩膜条带试件，用游标卡尺测量试件的厚度。生物力学实验在INSTRON-5544力学实验机上进行。

1.2.2.2.2 预拉伸实验 在实验过程中，每个豚鼠巩膜试件经10次循环加载，预循环载荷为0.005 N，预循环速度为0.5 mm·min－1，预拉伸实验载荷伸长后期，滞后环逐渐减小至消失，载荷伸长线环趋于稳定，加载卸载接近表明能量损耗趋于零。第9次和第10次曲线已非常接近，可以认为，预调10次可以达到要求[2]。

1.2.2.2.3 拉伸强度实验 预处理的试件在预拉伸的最后1个周期进行拉伸强度试验，载荷幅度为0.005～0.040 N，加载速度为0.5 mm·min－1，载荷、伸长随时间的变化都由与力学实验机相连的计算机自动记录，反映的是应力应变关系的曲线[2]。

1.2.2.2.4 蠕变实验 预处理过的试件随即进行蠕变试验，蠕变载荷为0.067 N，蠕变时间为60 min，载荷、伸长随时间的变化都由与力学实验机相连的计算机自动记录。根据力学公式算得蠕变率，蠕变率=(末位移－初位移)/(初位移+原长度)。对数据进行统计学分析。

1.2.3 盲法处理 实验中检影验光及所有测量均由另一位专业人员操作，操作人员不知被检眼是实验眼还是对照眼。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计分析。各组数据结果记录用均数±标准差表示。对照眼与实验眼间差异分别行配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 豚鼠实验性近视的诱导结果 凹透镜诱导豚鼠分别经过10 d、30 d、50 d凹透镜的诱导，实验眼与对照眼比较，均诱导出了明显近视，出现了眼轴相对延长，前后变化差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

表1 豚鼠凹透镜诱导前后双眼屈光度及眼轴长度变化Table 1Refraction and axial changes of dual eyes in guinea pig before and after lens－inducing(±s)

表1 豚鼠凹透镜诱导前后双眼屈光度及眼轴长度变化Table 1Refraction and axial changes of dual eyes in guinea pig before and after lens－inducing(±s)

Note:LIM:Lens induced myopia;SC:self-control;Compared with SC group，*P ＞0.05，＊＊P ＜0.05

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2.2 光镜观察结果 测量结果显示:A组实验眼巩膜厚度与对照眼相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。B组、C组两组实验眼巩膜厚度均比对照眼薄，差异有统计学意义(均为P＜0.05，见表2)。

A组除巩膜胶原纤维排列稍紊乱外，未见其他表现(图1)。B组巩膜胶原纤维排列稍紊乱，粗细不均，间隙变大(图2)。C组巩膜变化较明显，可见巩膜胶原纤维排列紊乱、粗细不均，纤维间隙变大;胶原纤维板层结构不清，局部出现纤维母细胞增生(图3)。

2.3 生物力学研究结果 C组实验眼的巩膜弹性膜量小于对照眼，实验眼巩膜的蠕变率大于对照眼巩膜的蠕变率，两者差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。A组、B组实验眼与对照眼的蠕变率、弹性膜量经统计学分析，差异均无统计学意义(均为P＞0.05;见表2)。

Figure 1 HE staining of retina，choroids and sclera of experimental eye in group A(×200) 光镜下A组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜HE染色结果(×200)

Figure 2 HE staining of retina，choroids and sclera of experimental eye in group B(×200) 光镜下B组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜HE染色结果(×200)

Figure 3 HE staining of retina，choroids and sclera of experimental eye in group C(×200) 光镜下C组豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜HE染色结果(×200)

3 讨论

豚鼠眼解剖结构、生理功能与人眼相似，且研究发现[3]通过计算机图像分析系统对正常豚鼠视网膜结构进行的定量分析表明豚鼠具有较好的视力。本实验研究以幼豚鼠(2周龄)为实验对象，采用凹透镜诱导的方法，分别在10 d、30 d、50 d内诱导出轴性近视和眼轴显著延长豚鼠，成功建立了实验性近视的动物模型。

表2 豚鼠凹透镜诱导实验眼与对照眼巩膜厚度、弹性模量及蠕变率比较Table 2 Comparison of thickness，elastic modulus and creep rate in scleral of guinea pigs between experimental eyes and control eyes(±s)

表2 豚鼠凹透镜诱导实验眼与对照眼巩膜厚度、弹性模量及蠕变率比较Table 2 Comparison of thickness，elastic modulus and creep rate in scleral of guinea pigs between experimental eyes and control eyes(±s)

Note:Compared with SC group，*P ＞0.05，＊＊P ＜0.05

Group Thickness(l/mm)Elastic modulus(P/MPa)Creep rate/%A LIM 0.35 ±0.03* 1.69 ±0.25* 12.56 ±3.05*SC 0.35 ±0.02 1.74 ±0.04 11.67 ±1.68 B LIM 0.34 ±0.03＊＊ 1.68 ±0.16* 13.76 ±8.50*SC 0.36 ±0.03 1.63 ±0.20 11.02 ±1.93 C LIM 0.32 ±0.03＊＊ 1.43 ±0.32＊＊ 17.70 ±6.98＊＊SC 0.37 ±0.02 1.74 ±0.32 8.62 ±2.13

豚鼠等哺乳动物的巩膜主要由胶原纤维、成纤维细胞和细胞外基质构成。研究发现，豚鼠形成近视眼时，后极部巩膜胶原优先受影响，由于后极部巩膜胶原减少，减弱了巩膜的抵抗力，使眼轴易于延展，而发生近视[4]。透镜诱导可以通过局部视网膜机制来调控临近巩膜生长，视觉信号通过某些途径转变为调控巩膜重塑的信号，巩膜重塑不会导致巩膜组织的净增长，但改变了巩膜组织的机械特性，降低了巩膜对正常眼压的抵抗力，引起眼球扩张和近视屈光度增加[5]。巩膜的病理学改变与生物力学特性改变是相关的。巩膜的生长发育、再生、愈合与应力密切相关器官的力学特性取决于它的组织结构，如胶原纤维的多少及空间的排列情况[6]。而胶原纤维的多少、粗细及排列直接影响着其器官的力学性质;从眼球壁外层、中层、内层3层的力学性能来看，外层巩膜最强，中层脉络膜次之，内层视网膜最弱。在同一应力水平下，三者的切线模量从视网膜到巩膜依次一个比一个高出一个数量级[7-8]，这说明巩膜在维持眼球形状方面起着关键作用。其本身结构决定其力学特性。Bell[9]指出有4种因素决定着个体巩膜的弹性模量，进而决定了巩膜是否延伸而发展成高度近视的后巩膜葡萄肿，它包括:(1)巩膜厚度;(2)胶原纤维的质量;(3)胶原纤维之间联系的程度;(4)周围环境的温度。王超英等[10]通过对人高度近视眼巩膜生物力学特性的初步研究发现，高度近视眼的巩膜比正常眼更容易变形，具有较低的承载能力。陈维毅等[11]人研究发现近视眼巩膜成纤维细胞的黏弹性等参数明显高于正常眼(即硬化)，巩膜成纤维细胞在近视发展过程中呈现出应变硬化现象。

本实验通过测量巩膜厚度，结果显示B组和C组两组实验眼巩膜厚度均比对照眼薄，光镜发现豚鼠实验眼的巩膜胶原纤维排列紊乱、纤维母细胞增生。随着诱导时间的延长，巩膜变薄，胶原纤维断裂，纤维细胞出现变性、水肿，出现纤维母细胞活化、分裂、增生，成为纤维细胞修复局部变性的胶原纤维。在诱导50 d时，实验眼的屈光度的变化最大，眼轴最长，光镜下巩膜的病理改变也最明显，同时生物力学实验研究的结果也表明，诱导50 d时豚鼠近视眼的巩膜的弹性模量小于对照眼，蠕变大于对照眼，说明实验性近视眼的巩膜较正常眼巩膜弹性差，具有较低的承载能力，易发生变形，这与人类高度近视眼的改变一致。本实验中诱导10 d和诱导30 d后，虽然实验眼分别诱导出(－5.48±2.01)D和(－7.04±1.31)D的相对近视，眼轴也分别延长了(0.52 ±0.22)mm 和(0.87 ±0.47)mm，巩膜开始出现组织病理学的改变，但其生物力学特性并未发生改变，说明巩膜的生物力学特性的改变要晚于组织病理学的改变。考虑巩膜是由胶原纤维、纤维细胞和细胞外基质构成，属于黏弹性材料，其变异系数较大，具有比较大的正常范围。在正常情况下，由于其黏弹性特性、组织内部的新陈代谢及其功能适应性生长，可使巩膜的变形达到一相对稳定的平衡状态，如果在一定的时间内，巩膜自身的结构及力学特性发生变化时，巩膜将产生变形并达到另一平衡状态，这时巩膜会产生永久变形。近视的形成是一个长时间逐渐发展的过程，随着实验性近视的屈光度增加、眼轴的延长，近视眼的巩膜在多种因素的影响下逐渐发生病理性改变，当其平衡状态被打破，巩膜的生物力学特性就会出现异常，其弹性承载力减弱。反过来，由于巩膜生物力学特性的改变，更加快了眼球的变形，形成恶性循环，最终使近视眼程度进一步加深。

巩膜的生物力学特性对于高度近视的发病有着重要的影响。巩膜的生物力学研究能更好的从组织细胞及分子水平了解视觉器官的生理功能，病理变化及相关治疗方法的机理，为临床近视眼的病因研究提供必要的理论基础。

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2 孙朝辉，王超英，靳胜利，王建仓，陈维毅.实验性近视眼巩膜生物力学特性的研究[J].眼视光学杂志，2006，8(4):209-213.

3 史剑波，徐锦堂，夏潮涌，狄静芳.豚鼠视网膜正常结构的定量研究[J].眼科研究，1999，17(2):98-100.

4 胡文政，褚仁远，张利能.豚鼠实验性近视眼巩膜羟脯氨酸含量的改变[J].眼科新进展，2001，21(5):321-322.

5 朱玉广，刘双珍.形觉剥夺性近视中巩膜变化的生物学机制[J].眼科新进展，2003，23(1):48-51.

6 Murakumo M，Ushiki T，Abe K.Three-dimensional arrangement of collagen and elastin fibers in the human urinary bladder a scanning electron microscopic study[J].J Urol，1995，154(1):251-256.

7 Wu W，Peters WH 3rd，Hanmer ME.Basic mechanical properties of retina in simple elongation[J].J Biomech Eng，1987，109(1):65-67.

8 Gerinec A，Slezakova G.Posterior scleroplasy in children with severe myopia[J].Bratisl Lek Listy，2001，102(2):73-78.

9 Bell GR.Biomechanical considerations of high myopia:part-1 physiological characteristics[J].J Am Optom Assoc，1993，64(5):332-338.

10 王超英，陈维毅，郝 岚.高度近视眼巩膜生物力学特性的初步研究[J].眼科研究，2003，21(2):113-115.

11 陈维毅，王超英，张全有，李阳阳，陈 静，董江峰.实验性近视眼巩膜成纤维细胞黏弹性研究[J].医用生物力学，2007，22(1):26-29.