β2－微球蛋白酶联免疫分析试剂盒的研制

2012-11-12李丽波官国英刘中瑞侯惠仁梁瑞鹏

同位素 2012年3期

李丽波，官国英，刘中瑞，侯惠仁，梁瑞鹏

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

β2－微球蛋白（β2－microglobin，β2－MG）是人体组织相容抗原（HLA）的一个β轻链，由淋巴细胞及有核细胞合成和分泌，相对分子质量为11 800。正常人β2－MG 的合成率及从细胞膜上的释放量相对恒定，β2－MG 可以从肾小球自由滤过，99.9%在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏，故而正常情况下β2－MG 的排出是很微量的。测定血清和尿液中的β2－MG可了解肾小球滤过功能以及肾小管的重吸收功能，是泌尿系统疾病中评价肾功能的灵敏指标［1］。另外，β2－MG因其能在免疫活性细胞的识别和激活中起主要作用，也是一种肿瘤标志物，恶性血液病或其他实质性恶性肿瘤细胞能合成和分泌β2－MG，且其量超过正常细胞，使患者血清β2－MG 含量明显升高。

临床上血清β2－MG 的检测主要有以下几个方面的作用［2－5］：1）作为肾脏功能的灵敏指标，用于评价泌尿系统疾病中肾脏的功能；2）作为反映高血压和糖尿病肾脏受损的敏感指标，动态观察、诊断早期肾移植排斥反应；3）作为一种肿瘤标志物辅助诊断恶性肿瘤，评价骨髓瘤的预后及治疗效果；4）病毒感染及自身免疫性疾病时血清β2－MG 会升高。

目前临床上检测β2－MG 的方法主要有放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫分析法（ELISA）、时间分辨荧光免疫分析法、免疫透射比浊法及增强免疫比浊法等。其中酶联免疫分析法因操作简便、检测迅速、无放射性污染、仪器设备价廉而倍受中小医院的青睐。本工作拟采用竞争法研制β2－MG 的酶联免疫分析试剂盒。

1 主要试剂和仪器

1.1 主要试剂

β2－MG：SCIPAC 公司，辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）、四甲基联苯胺（TMB）、脲素过氧化氢（H2O2）：美国Sigma公司；抗β2－MG 多克隆抗体：原子高科股份有限公司。正常人血清：核工业401医院检验科提供。放射免疫分析试剂盒：原子高科股份有限公司。

1.2 主要仪器

SPECTURE酶标仪：奥地利SLT公司；GAMMA－C12γ计数器：DPC 公司；PYX－DHS－60X75－BS电热培养箱：上海跃进医疗器械厂。

2 实验方法

2.1 β2－MG 酶标记物的制备

采用高碘酸钠氧化法制备β2－MG 酶标记物［6－7］。称取1.0mg HRP溶于0.1mL 双蒸水中，搅拌下加入0.1mL新鲜配制的0.06mol／L高碘酸钠（NaIO4）水溶液，4℃静置30 min；取出，搅拌下加入0.1mL 0.16mol／L的乙二醇水溶液，室温下静置30min。将1.0mg（500μL）β2－MG 的水溶液加入上述溶液中，混匀后，装入透析袋对0.05mol／L pH 9.5的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜。次日，将溶液自透析袋取出，加入0.04 mL 新配制的NaBH4蒸馏水溶液（5g／L），混匀，4℃静置2h；取出反应液，装入透析袋对0.02 mol／L pH 7.4 的磷酸缓冲液4℃透析过夜，取出透析液，加等体积甘油，－20℃贮存备用。

2.2 固相抗体的制备

向聚苯乙烯微量滴定板孔中按每孔200μL滴加含β2－MG 多克隆抗体的pH 9.6碳酸缓冲液，置4℃冰箱内过夜，次日取出后置37℃封闭1h，制得酶标板，用于免疫反应。

2.3 β2－MG 标准品的配制

用胎牛血清将已知浓度的β2－MG 溶液按要求依次稀释，配制成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10mg／L的系列标准品，分装，冻干，4℃贮存备用。

2.4 底物溶液和终止剂

将TMB和H2O2分别溶于pH 5.0柠檬酸－磷酸缓冲液中，使其浓度分别为0.6 和1.2mmol／L，使用时以体积比1∶1混合即为底物溶液。终止剂为2mol／L H2SO4溶液。

2.5 β2－MG－ELISA分析程序

采取一步法加样程序：在包被有β2－MG 多克隆抗体的微量滴定板中按每孔20μL 滴加待测样品或标准品和每孔180μL酶标记物，混匀，37℃下温育50 min，弃反应液，用含0.05%Tween－20的洗涤液洗5次，再按每孔200μL加入底物液，避光，37℃下显色15min，以（2mol／L）H2SO4溶液按每孔50μL终止显色，于450nm处测定其光密度OD450；以标准品浓度的对数为横坐标，OD450为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线进行线性拟合从而计算样品中β2－MG 含量。

3 结果及讨论

3.1 方法学建立

3.1.1 β2－MG 酶标记物（β2－MG－HRP）滴度的选择用含0.2%BSA 的磷酸盐缓冲液将β2－MG－HRP稀释为1∶12 000、1∶10 000、1∶8 000和1∶6 000的工作液用于β2－MG－ELISA实验，结果列于表1。表1 显示，随着滴度的增大，各标准点的OD450也随之增大，当酶标记物稀释度为1∶8 000时，标准点0.2、5、10mg／L与对应的零标准点的OD450之比均较大，说明其抑制效果较好，可以满足免疫分析的要求。因此，选择酶标记物的滴度为1∶8 000。

3.1.2 β2－MG 抗体包被浓度的选择 β2－MG抗体包被浓度分别为1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0mg／L，进行β2－MG 酶免疫分析，选择最佳β2－MG 抗体包被浓度，结果列于表2。由表2可知，当包被浓度为5 mg／L 时，“0“标准点的OD450值适中，加入标准品浓度为0.2mg／L 时，OD450与零标准点的OD450之比为76.2%，抑制比较明显，且此时抗体用量较少，故选择抗体包被浓度为5.0mg／L。

表1 β2－MG酶标记物（β2－MG－HRP）滴度的选择

表2 抗体包被浓度的选择

3.2 方法学鉴定

3.2.1 标准曲线与灵敏度 β2－MG－ELISA 标准曲线示于图1。同时测定20 个零标准的OD450，以其平均值减去2s计算其分析灵敏度为0.15mg／L。

图1 β2－MG ELISA标准曲线

3.2.2 精密度重复测定3份含有不同β2－MG浓度的人血清样品，观察批内、批间变异，结果列于表3。表3显示，批内变异为4.1%～11.2%，批间变异为14.1%～16.0%。

3.2.3 准确性取3份不同β2－MG 浓度的人血清样品分别加入已知浓度的β2－MG 标准品中，测定β2－MG回收率，结果列于表4。表4显示，回收率为93.3%～115.9%。

3.2.4 稀释实验取β2－MG 含量较高的人血清样品用β2－MG 零标准进行倍比稀释，测定结果列于表5。经计算，稀释相关方程为y＝4.279x－0.122 6，相关系数r＝0.997 4。

3.2.5 特异性用零标准品对高浓度的甲胎蛋白（α－fetoprotein，AFP）、铁蛋白（Ferritin，Fer）、白蛋白（Albumin，ALB）进行系列稀释（1～10mg／L），并作为样品在本系统中测定，结果列于表6。由表6 可知，Fer、ALB 在浓度低于10mg／L时无明显交叉反应，AFP 在浓度低于5mg／L时交叉较小。