ABO基因定型法解决临床疑难血型定型1例

赵志弘 石翠英 乔芳 王振雷 田亚娟 张虹 刘敬闪

近些年来，随着城市人口的激增，血站不仅在采供血量上增长很快，而且在实际工作当中出现了更多的正反定型不符标本，这些标本有来自血站内部检验科的，也有来自医院临床的。传统的血清学检测方法由于其自身局限性［1］，因此面临很大的挑战。笔者在实际工作中运用ABO基因定型方法解决了一些疑难血型定型的常见问题，本文以1例正反定型不符标本的鉴定为例报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 患者，女，汉族，87岁，2011年1月因褥疮入住市第一医院治疗，曾有输血史。因ABO血型正反定型不符送我血液中心配型科鉴定。

1．2 血型血清学试验 按照文献［2］操作。抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白试剂、标准试剂ABO红细胞、谱细胞均由上海血液生物医药有限责任公司制备。

1．3 血型基因定型 采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术。DNA提取严格按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行。引物为采用瑞典隆德Olsson等［3］研究小组与笔者自行设计，内对照为扩增人类生长激素基因(HGH)，均由上海生工合成。PCR扩增仪为美国ABI公司9700。引物混合物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小见表1。引物序列见表2。

表1 基因分型引物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小

表2 引物序列

1．4 PCR反应体系 总反应体系10 μl，引物浓度10 pmol/μl，dNTPs浓度 10 pmol/μl，基因组 DNA 浓度 50 ng/μl，15 mmol/L MgCL2(SIGMA 公司)，内对照引物浓度 5 pmol/μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶(Promega)，甘油和甲酚红终浓度分别为5%和0．01%(SIGMA 公司)。

1．5 PCR循环参数 采用热启动DNA变性技术96℃预置7 min，然后按 94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min 进行 32 个循环，再72℃延伸2 min。

1．6 电泳 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴别，电压153 V，时间15 min，DNA Marker DL2000为TRAASTM公司产品，凝胶成像仪拍照观察结果。

2 结果

血清学鉴定结果及基因定型结果见表1，图1。

表1 患者血清学结果

图1 患者基因定型结果

3 讨论

患者血型血清学结果正反定型不符，正定型为B型，反定型为O型。因反定型B、O细胞亦发生凝集，自身细胞亦凝集，提示该献血员血清中存在冷凝集素。37℃水浴后，反定型B、O自身细胞凝集消失，证明该患者血清中存在冷凝集素。至此，定型不符的原因找到。基因定型图谱显示出了其BO基因型:1、4泳道为O基因，2、3泳道为 A 基因，3、5、6泳道为B基因。患者样本在3、4、5、6泳道扩增出了特异性条带。

综上所述，此类标本在血站或医院血库的日常工作中经常遇到，具有较典型的代表性，应用ABO基因定型方法，在3 h内可完成从DNA抽提到基因扩增的完成，快速、高效，相对血型血清学方法，其能在较短时间内准确解决疑难血型标本的定型问题。血型基因定型技术是现代分子生物技术发展的产物，具有不受检材限制、不受疾病影响(白血病患者存在血型抗原表达减弱现象)、不受血清中不规则抗体、自身抗体的影响及不受假凝集(冷凝集素、血浆蛋白紊乱等)影响的优点。因此，基因定型技术是血型血清学方法的极好补充，又是广大血型工作者手中的新武器。

1 赵桐茂．后基因组时代的免疫血液学．中国输血杂志，2010，23:848-849．

2 肖星甫主编．输血技术手册．第1版．四川:科学技术出版社，1992．494-514．

3 Olsson ML，Chester MA．Frequent occurrence of a variant allele at the blood group ABO locus．Vox Sang，1996，70:26-30．