不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut－4含量变化的研究

薛伟善

(辽宁师范大学体育学院，辽宁大连 116029)

不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut－4含量变化的研究

薛伟善

(辽宁师范大学体育学院，辽宁大连 116029)

为了解运动强度相同而运动时间不同对鼠肌葡萄糖载体－4(Glut－4)蛋白表达及含量的影响，采用制备糖尿病大鼠模型方法将SD大鼠分为正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病运动组(20min组、40min组、60min组和80min组)等6组，以20m/min的强度进行8周的跑台运动，用Western blot免疫印迹法检测运动后GLUT－4蛋白含量。结果表明，与糖尿病对照组相比，运动时间20min、40min组、60min组和80min组的股四头肌Glut－4蛋白含量显著升高(P＜0.01);与20min组相比，运动时间40min组、60min组及80min组的Glut－4蛋白含量显著升高(P＜0.01)，认为运动时间对Glut－4蛋白含量产生明显的影响，运动时间达40min以上可能具有更好的效果。

不同运动时间;2型糖尿病大鼠;Glut－4含量

－4(Glut－4)蛋白含量降低和活动异常是主要原因［1］。以往的研究发现运动可提高骨骼肌细胞膜Glut－4蛋白的含量［2－3］，有助于Glut－4在骨骼肌细胞细胞膜上的易位，加快葡萄糖进入细胞内的速度。以往的研究虽然观察了运动对

Glut－4含量的影响，但这些研究均没有深入研究不同时间运动的影响。运动时间在运动处方构成的诸要素中尤为重要，机体对不同的运动时间产生不同的应答。糖尿病患者在进行康复锻炼时，有关Glut－4蛋白的表达及含量随不同运动时间的变化而改变的规律还不很清楚，系统的研究更少见。由于不清楚不同时间的运动对Glut－4蛋白的影响，因此在实践指导时就缺乏科学的理论依据，使2型糖尿病患者在进行运动康复锻炼时就具有一定的盲目性。因而开展此领域的研究，则具有重要的理论和实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

选用70只健康SD(Sprague－Dawley)大鼠(不分雌雄，体质量为200g±14g)，SD大鼠由大连医科大学动物饲养中心提供。在标准环境下分笼喂养，自由摄取水和食物，在喂养1周后进行适应性运动训练。实验分组为正常对照组(NC)10只，实验组60只，均随机选取。

1.1.1 制备2型糖尿病模型 2型糖尿病大鼠模型的制备参照洪丽莉等的实验［4］。方法是喂食4周的自备高糖高脂饲料，并在饮水中添加浓度3%的果糖。同时按30mg/kg体重的剂量一次性腹腔内注射 STZ的混合制剂:pH4.4，0.1mmol/L柠檬酸缓冲液。在注射1周后，测试大鼠葡萄糖耐量。具体方法是大鼠禁食4～6小时，腹腔注射葡萄糖(按2g/kg体重的标准)，断尾采血，分别测定0、60和120min血糖的动态变化，糖尿病的诊断标准为:空腹血糖连续2次高于等于 7.8mmol/L、或葡萄糖负荷后 2h血糖高于等于11.1mmol/L［5］。本实验造模的成功率可达85%。将符合标准的50只大鼠随机分为糖尿病对照组、20min、40mi、60min及80min运动组，并继续高脂饲料喂养。2周后(大鼠禁食12h后)断尾取血测空腹血糖及胰岛素值。高糖高脂饲料配方:100kg饲料中添加人全蛋粉6kg、蔗糖23kg、炼猪油26.5kg，混和成形，其总热量为20.103J/g，其中蛋白质占15%，碳水化合物占50%，脂肪占25%。

1.1.2 制定运动模型 参照Soya等的实验［6］，本实验选20m/min强度的运动为负荷标准，进行时间为8周，方式为跑台运动，实验组分为:20min组、40min组、60min组和80min组。对照组大鼠常规喂养。本实验过程中对动物的处置，符合有关的国际动物伦理学标准。本实验由R＆D Systems公司提供GLUT－4多克隆抗体、由英国Amersham公司提供ECL、New England BioLabs预染蛋白Marker、国强生公司提供快速血糖仪及试纸。胰岛素的测定采用放射免疫法，由南京生物工程研究所提供试剂盒。由北京福瑞生物工程公司提供甘油三酯和总胆固醇试剂盒。由北京硕林苑科技有限公司提供动物跑台，大鼠跑台型号为SLY－RTML。

1.2 实验方法

1.2.1 收集标本 8周后，最后一次运动24h后，按50mg/ kg的标准腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，提取后肢股四头肌肉组织并置于液氮中冷冻。

1.2.2 制备股四头肌肌细胞膜 肌膜的制备参照Huisman等人的实验［7］。取100g股四头肌肌肉组织，冰上剪碎并加入裂解液［Tris－HCL20mol·L－1(pH7.5)，蔗糖330mol· L－1，EDTA 0.5mol·L－1，PMSF 1mol·L－1，Lepetin25mg· L－1］。离心机上1000r·min－1的标准离心10min。取上清液并以40000r·min－1的标准冷冻超速离心1h并弃上清。在所得沉淀中，再次加入裂解液，用超声裂解的方法循环7次萃取，再以40000r·min－1的标准冷冻高速离心1h所得上清即是细胞膜组织。蛋白浓度的测定采用改良 Lowry法［8］。GLUT－4蛋白含量的测定采用Western blot免疫印迹法，取股四头肌肌细胞膜样品50μg先进行SDS－PAGE蛋白分离，然后将蛋白电转移至NC(硝酸纤维素)膜上，再用奶粉(5%脱脂)TBS封闭，控制温度4°C并过夜。室温加抗Glut－4单克隆抗体1h，洗膜后，加辣根过氧化物酶标记的二抗1h，与ECL反应1min后即刻与X光片曝光并洗片，用图像分析仪扫描(德国产Leica Q550－IW)，计算光密度并进行定量分析。以正常对照组的Glut－4蛋白含量为100计算其他各组的相对含量。

1.2.3 数理统计法 对所得实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。显著性水平为0.05。统计软件采用SPSS 15.0。

2 实验结果

与对照组相比，在糖尿病建模后，反应2型糖尿病特征的指标如体重、血清甘油三酯、总胆固醇、血糖和胰岛素水平明显升高(P＜0.01)。

表1 造模成功后两组体重、血糖、血脂和胰岛素水平的变化

对照组大鼠比，糖尿病对照组肌膜Glut－4蛋白含量明显下降(P＜0.01)。与糖尿病对照组大鼠比，20min、40mmin、60min和80min组股四头肌Glut－4蛋白含量显著升高(P＜0.01)。与20min组相比，运动时间40min、60min及80min组GLUT－4蛋白含量显著升高(P＜0.01)。运动时间达40min后，随着运动时间的增加，Glut－4的含量不再随着运动时间的增加而增加。

表2 不同运动时间对GLUT－4蛋白含量及磷酸化的影响

3 分析与讨论

葡萄糖的跨膜转运是以易化扩散方式实现的、并由位于细胞膜上的葡萄糖载体介导的。目前已发现有6种葡萄糖转运蛋白，它们分别被命名为葡萄糖转运蛋白1－5，以及葡萄糖转运蛋白7［9］。Glut－4是一种由509个氨基酸组成的糖蛋白，(分子量约48000)。在静息状态下绝大部分Glut－4位于细胞内的各种细胞器上［10］，主要分布在微粒体、高尔基体和肌丝网等重要细胞器的膜上［11］。也有学者认为在细胞内，存在对胰岛素敏感的、富含Glut－4的特异性囊泡样膜结构。在葡萄糖转运蛋白基因家族中Glut－4蛋白主要分布在肌肉和脂肪组织中其中小部分Glut－4位于细胞膜上。目前研究认为，运动和胰岛素是刺激骨骼肌Glut－4转位和转运葡萄糖的两个最重要因素。目前对这两个因素对Glut－4的转位是否具有同样的效力，学术界仍存在很大的争议和分歧。但是，几乎所有的实验都已证实，运动和胰岛素是通过不同的信号途径诱发GLUT－4发挥转运葡萄糖作用的，其中胰岛素是主要通过PI3K(磷脂酰肌醇－3－激酶)途径，而运动认为主要与AMPK(激活丝裂原活化蛋白激酶)的活动有关。

依据Soya的大鼠跑台实验，20m/min相当于LT(Lactate Threshold)强度运动，15m/min为低于LT强度(Sub－LT)的运动，而25m/min和30m/min为高于LT强度(Supra－LT)的运动。LT为代谢的转折点，是有氧代谢向无氧代谢转换的临界点，其运动强度相当血乳酸浓度4mmol/L，当运动强度高与LT时机体的代谢方式开始转向无氧。本实验结果显示，经过8周不同运动时间的运动，运动组血糖和胰岛素均产生良好的改变，与其他学者的实验结果相同［12］。本研究显示，经过8周运动后，骨骼肌Glut－4含量均有显著增加，但当运动时间达到40min以上后与20min组相比，效果最好。以前的实验显示运动能更多地促进GLUT－4 mRNA的表达［13］，Dela等的实验也发现，运动能明显提高Glut－4含量［14］。本研究也显示，运动时间可对Glut－4的含量产生显著影响，随着运动时间的延长，Glut－4的含量逐渐增加，但当运动时间达到40min以上后，Glut－4的含量达到峰值，不再随运动时间的增加而增加。提示，在2型糖尿病的康复锻炼中，运动时间要有个时域，为了更好地促进血糖的有效利用和提高机体的糖代谢水平，在适当地确定运动强度的基础上，将运动时间控制在40min以上可能对2型糖尿病患者的康复更加有利。

综上，2型糖尿病动物模型进行20m/min强度运动时，在不同运动时间影响下，骨骼肌Glut－4含量均增加，但运动时间达到40min后，Glut－4含量增加的效果更好。

［1］Ramlal T，Rastogi S，Vranic M，et al．Decrease in glucose transporter number in skeletal muscle of mildly diabetic(streptozotocin－treated)rats［J］．Endocrinology，1989，125(2):890－897．

［2］Tsai YL，Hou CW，Liao YH，et al．Exercise training exacerbates tourniquet－induced decreases in GLUT－4 expression and muscle atrophy in rats［J］．Life Sci，2006，78(25):2953－2959．

［3］Chou CH，Tsai YL，Hou CW，et al．Glycogen overload by postexercise insulin administration abolished the exercise－induced increase in GLUT－4 protein［J］．J Biomed Sci，2005，12(6):991－998．

［4］洪丽莉，许冠荪，申国明，等．SD大鼠2型糖尿病模型的建立［J］．中国比较医学杂志，2005，15(6):379－381．

［5］郭啸华，刘志红，李 恒，等．实验性2型糖尿病大鼠模型的建立［J］．肾脏病与透析肾移植杂志，2000，9(4):351－355．

［6］Soya H，Mukai A，Deocaris CC，et al．Threshold－like pattern of neuronal activation in the hypothalamus during treadmill running: establishment of a minimum running stress(MRS)rat model［J］．Neurosci Res，2007，58(4):341－348．

［7］Huisman B，Zyl MV，Keyser A，et al．The effect of insulin and B－a－drenergic stimulation on glucose transport，glut－4 and PKB activation in the myocardium of lean and obese Non－insulin dependent diabetes mellitus rat［J］．Mol Cell Biochem，2001，223:15．

［8］Lowery OH，Rosebrough HJ，Farr AL，et al．Protein measurement with the folinphenol reagent［J］．J Biol Chem，1951，193:265－275．

［9］Wright DC．Mechanisms of calcium－induced mitochondrial biogenesis and GLUT－4 synthesis［J］．Appl Physiol Nutr Metab，2007，32(5):840－845．

［10］Fueger PT，Li CY，Ayala JE，et al．Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT－4 glucose transporter［J］．J Physiol，2007，582(2):801－812．

［11］Hoene M，Lehmann R，Hennige AM，et al．Acute regulation of metabolic genes and insulin receptor substrates in the liver of mice by one single bout of treadmill exercise［J］．J Physiol，2009，587 (PT1):241－252．

［12］Jiang L，Shi M，Guo L，et al．Effect of M35，a neuropeptide galanin antagonist on glucose uptake translated by glucose transporter 4 in trained rat skeletal muscle［J］．Neurosci Lett，2009，467(2):178－181．

［13］Ikemoto T，Hosoya T，Takata K，et al．Functional role of neuroendocrine－specific protein－like 1 in membrane translocation of GLUT－4［J］．Diabetes，2009，58(12):2802－2812．

［14］Dela F，Ploug T，Handberg A，et al．Physical training increases muscle GLUT－4 protein and mRNA in patients with NIDDM［J］．Diabetes，1994，43(4):862－868．

Effects of Different Times’Exercise on Glut-4 Content in Skeletal Muscle of Type 2 DM Rats

XUE Weishan
(Physical Education Institute of Liaoning Normal University，Dalian 116029，Liaoning，China)

Objective:To explore the effects of different times’exercise on GLUT-4 protein content in type 2 DM rats．Method:Sixty SD rats were divided into six groups:normal control group(NC)、diabetes mellitus group(DMC)and 20min、40min、60min and 80min exercise group．The exercise groups did exercise for 8 weeks．The contents of GLUT-4 protein were measured by Western bolt analysis．Result:The contents of IRS-2 protein in 20min，40min，60m/min and 80min group enhanced(P＜0．01)respectively compare with the DMC group，and 40min，60min and 80min group enhanced (P＜0．01)compare with 20min group．Conclusion:The results showed that the exercise times have affected the contents of GLUT-4 protein，exercise times over 40min may have the better effect．

different times’exercise;type 2 diabetic rat;GLUT-4content 2型糖尿病明显的特征是血液葡萄糖升高，但外周组织细胞摄取葡萄糖却存在障碍，研究证实细胞膜上葡萄糖载体

G805.52

A

1004－0560(2012)04－0083－03

2012-05-06;

2012-06-15

国家自然科学基金项目(30970348)。

薛伟善(1958－)，男，副教授，主要研究方向为体育教学与运动健康促进。

责任编辑:乔艳春

◂运动人体科学