粉防己碱对雄黄所致小鼠免疫功能低下的影响

李祥华，高 林，余万桂，黄江荣 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

张家均 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院检验科，湖北 荆州 434000)

许甲凤，杜亚明 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

粉防己碱对雄黄所致小鼠免疫功能低下的影响

李祥华，高 林，余万桂，黄江荣 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

张家均 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院检验科，湖北 荆州 434000)

许甲凤，杜亚明 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：探讨雄黄中毒所致小鼠免疫功能低下后粉防己碱(Tet)的调节作用。方法：取小鼠随机分为正常对照组，模型对照组，粉防己碱(tetrandrine，Tet)高、中、低剂量组，二巯基丙磺酸钠(DMPS)组。正常对照组给予生理盐水，模型组灌胃给予70mg/kg雄黄混液，Tet高、中、低剂量组分别腹腔注射给予Tet 98.0、49.0、24.5mg/kg，连续42d。采用重量法称量小鼠脾脏和胸腺质量，以其质量与体质量之比作为胸腺和脾脏指数。Giemsa染色计数腹腔巨噬细胞(PMΦ)并计算吞噬百分率和吞噬指数。用比色法测定红细胞(RBC)裂解释放的空斑形成细胞(PFC)量。观察Giemsa染色后淋巴细胞个数并计算母细胞转化率。结果：Tet能增加小鼠脾脏和胸腺的重量，增强小鼠PMΦ的吞噬能力(Plt;0.01)，提高小鼠溶血值，增加PFC数(Plt;0.01)，能提高小鼠淋巴细胞转化率(Plt;0.01)，且有一定剂量差异。结论：对于雄黄所致的小鼠免疫功能低下，Tet的免疫增强作用可能是能使胸腺和脾脏重量增加，PMΦ的吞噬能力增强，淋巴细胞的转化率升高及抗体能力加强等作用有关。

粉防己碱；雄黄；免疫调节剂

近年来，随着人们对雄黄及雄黄复方的深入研究和广泛的临床应用，雄黄受到广泛关注。但临床常有雄黄中毒甚至死亡的报道。雄黄中毒的反应是多方面的，其表现为：影响蛋白质酶的活性，损害神经，影响脂质过氧化物代谢，损伤组织器官，影响免疫功能，引起免疫力下降。此外，损害细胞染色体，阻止细胞正常分裂，麻痹血管平滑肌。前人有用粉防己治疗其中毒，解除其毒性的报道。前期的研究作用表明，粉防己碱(Tetrandrine，Tet)对雄黄中毒动物有促进砷排泄作用[1]。作者以Tet作为解毒剂，对其免疫增强作用进行了探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验药物 Tet为江西银涛制药有限公司产品。雄黄购自湖北省荆州市中药材公司，经荆州市药品检验所刘以民副主任药师鉴定为产于湖南的雄黄正品。二巯基丙磺酸钠(DMPS)注射液(上海天丰药厂)，批号021201。

1.1.2动物 清洁级小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(鄂)2004-0028。

1.1.3试剂 Giemsa.染液、淋巴细胞分离液，上海化学试剂厂，批号 070713；PRMI-1640、植物血凝素(PHA)，Sigma公司(美国)，批号 3305RB560；L-谷氨酰胺，上海东风化学试剂厂，批号0511143；小牛血清，杭州四季青生物工程公司，批号20070506。

1.1.4仪器 ThermoLabsystems Multisken M3 型酶标仪，芬兰；LD4-2A型低速离心机，北京离心机厂；765C型分光光度计，上海分析仪器厂；Leica DMLB2型光学显微镜，德国；PG3022型酶联免疫检测仪，华东电子管厂。

1.2方法

1.2.1实验动物分组与处理 取小鼠，随机分为正常对照组，雄黄(模型)组，模型+Tet高、中、低剂量组，模型+DMPS组，每组20只。

1.2.2给药方法 除正常对照组外，各组每鼠每日上午ig给予雄黄70mg/kg，连续6周，实验期间，普通饲料喂养。中午12时停食不停水，下午18时Tet高、中、低剂量组分别ip给予98.0、49.0、24.5mg/kg的Tet注射液；DMPS组ip 7mg/kg的DMPS注射液。给药6d后停药1d为1个周期，连续6个周期。正常对照组给予同样量的生理盐水同法处理。

1.2.3小鼠免疫器官指数的测算 于给药的最后一天，颈椎脱臼处死动物，剖腹，立即取脾脏、胸腺称重，按文献[2]方法计算每组动物器官指数。

1.2.4小鼠PMΦ吞噬功能的测定 于给药的最后一天，按文献[2]方法每鼠ip 10%蛋白胨0.2ml，32h后ip新鲜鸡RBC 0.5ml，30min后处死动物，立即剖腹，洗出腹腔液，37℃温育15min 后离心，取细胞悬液涂片，甲醇固定，Giemsa染色后在油镜下计数200个MΦ。以MΦ吞噬鸡 RBC 的吞噬百分数和吞噬指数为指标表示药物对小鼠PMΦ吞噬功能的影响。

1.2.5小鼠空斑形成细胞(PFC)量的测定 于给药的最后一天, 按方法[3]每鼠ip 5% SRBC 0.2ml，4d 后放血致死，取脾脏，制成脾细胞悬液 ( 约5×106个/ml )。取该悬液0.5ml，加入0.2% SRBC和1∶10 小鼠血清各0.5ml，混匀。另设不加补体作为空白对照，37℃ 温育1h 后离心，取上清液比色(波长r=413nm)，测定 RBC裂解释放的PFC量 ( 以D143值表示 )。

1.2.6小鼠淋巴细胞转化率的测算 于停药后的次日，小鼠眼球取血，肝素抗凝。参考文献[3]方法，取血0.1ml加入1.8ml灭菌的PRMI-1640(内含20%小牛血清，30.0g/L谷氨酰胺1.0ml)，再加入PHA 0.1ml，37℃温育3d后吸出血清，加8.5g/L NH4Cl 4ml，混匀后37℃水浴10min，离心。取沉淀物滴加于玻片上，Giemsa染色液染色，油镜下观察200个淋巴细胞，计算其母细胞转化率。

1.3统计学分析

2 结 果

2.1Tet对小鼠免疫器官指数的影响

实验结果显示，试药三个剂量组均可增加脾脏和胸腺指数，与正常对照组比较，高、中剂量组局均有非常统计学差异(P均lt;0.01)；与模型组比较，高、中、低三个剂量组亦显示非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表1。

表1 Tet对小鼠免疫器官指数的影响

2.2Tet对小鼠PMΦ吞噬功能的影响

结果表明，Tet高、中、低三个剂量组均能提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指数。与正常组比较，Tet高、中剂量组有非常统计学差异(P均lt;0.01)，低剂量组也有统计学差异(Plt;0.05)。与模型组比较，Tet高、中、低剂量组有非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表2。

表2 Tet对小鼠PMΦ吞噬功能的影响

2.3Tet对小鼠PFC的影响

结果表明，Tet各组均能提高小鼠溶血值，增加PFC数，与正常对照组比较，高剂量组有非常统计学差异(Plt;0.01)，中、低剂量组也有统计学差异(P均lt;0.05)。与模型组比较，高、中、低三个剂量组均有非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表3。

2.4Tet对小鼠淋巴细胞转化率的影响

实验结果表明，Tet不同剂量均能提高淋巴细胞转化率。与正常对照组比较，Tet高剂量组有非常统计学差异(Plt;0.01)；中、低剂量组也有统计学差异(P均lt;0.05)。与模型组比较，Tet高、中、低三个剂量组也显示出非常统计学差异 (P均lt;0.01)。结果见表4。

表3 Tet对小鼠PFC的影响

表4 Tet对小鼠淋巴细胞转化率的影响

3 讨 论

在上个世纪90年代，有人研究发现，Tet是一种天然的免疫抑制剂，对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用。Tet可通过干扰细胞跨膜信号传递，抑制分裂原刺激淋巴细胞增殖、B细胞合成抗体及NK细胞介导细胞毒性作用。Tet还可通过下调T细胞蛋白激酶C信号转导通路，抑制T细胞增殖，减少IL-2的分泌及下调T细胞激活抗原CD71的表达产生免疫均有抑制作用。Tet可剂量和时间依赖性的地引起小鼠腹腔巨噬细胞、豚鼠肺巨噬细胞和小鼠巨噬细胞样细胞系J774细胞活性丧失，抑制巨噬细胞呼吸爆发，减少氧自由基的生成，下调多种炎性细胞因子的合成与释放[4]。亦可剂量依赖性抑制内毒素、PMA及二氧化硅诱导肺泡巨噬细胞NF-KB的激活及NF-KB依赖性基因的表达，但对核转录因子SP-1的DNA结合活性及SP-1依赖报告基因无影响，这一作用与抑制IKB降解的某些信号转导通路、清除氧自由基有关[5]。Tet还可显著抑制N-甲酰基蛋氨酸、亮氨酸等诱导的嗜中性白细胞、巨噬细胞趋化蛋白-1表达上调、自由基聚集及对纤维蛋白原粘附[6]。Tet在体内外均有较好的免疫抑制作用，且与抗风湿药物具有协同作用，还可减少不良反应，但其机制不同于其他抗风湿药[7]。

雄黄中毒后，机体的免疫功能下降。我们研究发现，Tet在促进雄黄中毒动物砷排泄时，能调节其免疫功能。研究结果表明，给予Tet不同剂量时，能增加小鼠脾脏和胸腺指数，提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指数，提高小鼠溶血值，增加PFC数，提高淋巴细胞转化率。这表明Tet在治疗雄黄中毒时，能发挥其双重作用。

[1]李祥华，高林，余万桂，等. 粉防己碱对雄黄中毒大鼠尿砷血砷含量的影响[J]. 中国医院药学杂志，2009，29(24)：2083-2085.

[2] 李仪奎. 中药药理实验方法学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1991：155.

[3] 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京：人民卫生出版社，2002：1433-1456.

[4] Pang L, Hoult J R. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine, an antisilicosis alkaloid,accompanied by on overproduction of prostaglandins [J]. Biochem Pharmacol，1997，53(6)：773-779.

[5] Chen F，Lu Y，Demers L M，et al. Role of hydroxyl radical in silica-induced NF-kappa B activation in macrophages [J]. Ann Clin Lab Sci，1998，28(1)：1-8.

[6] Shen Y C，Chen C F，Wang S Y，et al. Impediment to calcium influx and reactive oxygen production accounts for the inhibition of neutrophil Mac-1 up-regulation and adhesion by tetrandrine [J]. Mol Pharmacol，1999，55(1)：186-191.

[7] Lai J H. Immunomodulatory effects and mechanism of plant alkaloid tetrandrine in autoimmune diseases [J]. Acta pharmacol Sin，2002，23(12)：1093-1099.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.001

R963

A

1673-1409(2012)01-R001-03

2011 10 25

湖北省科技攻关项目(2006AA301C34)

李祥华(1953)，男，湖北松滋人，教授，主要从事中医药学教学与研究工作。