肺金生方对Lewis肺癌小鼠VEGF-C、nm23表达的影响

庞德湘 周 楠 边至慰 浙江中医药大学附属第二医院肿瘤科 杭州310053

原发性支气管肺癌（简称肺癌）是全球常见的恶性肿瘤，第三次全国居民死因调查结果显示，我国肺癌的病死率与30年前相比上升了46.5%，已成为我国首位恶性肿瘤死亡原因[1]。肺金生方由《金匮要略》经典方泽漆汤结合现代药理实验结果化裁而成，临床治疗肺癌患者疗效显著[2]，近年有关于其疗效的临床报道，但有关其抗肿瘤机制的研究尚为少见。本实验通过观察肺金生方对Lewis 肺癌小鼠VEGF-C、nm23表达的影响，探讨肺金生方抗肿瘤转移的机制及途径，从而为临床使用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物及瘤株 C57BL/6小鼠60只，雄性，5～6周龄，体质量18～20g，清洁级，购自浙江中医药大学动物实验中心。Lewis荷瘤鼠：购自浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 药 物 肺金生方，由泽漆30g，前胡10g，人参、桂枝各9g，红豆杉枝8g，蜂房15g，石见穿30g 等组成，按《中药药理研究方法学》计算小鼠的等效剂量，肺金生方低、中、高剂量分别相当于临床成人用量的5、10、20 倍，常规水煎，取煎液浓缩，浓缩成0.925、1.85、3.7g/mL。灭菌后置4℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂及仪器 兔抗鼠VEGF-C、VEGFR-D、P53、nm23、PCNA 单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，多聚赖氨酸、SP-9001、DAB试剂盒购于杭州达文生物有限公司。超净台（苏州净化设备有限公司），电子显微镜（日本，Nikon.E80i型），多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）；切片机（德国莱卡RM2015）；离心机（北京离心机厂LDZ5-2 型）；干燥箱（日本三洋MIR-153型）；恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型）。

2 实验方法

2.1 动物造模及分组 将Lewis 荷瘤小鼠脱颈椎处死，放入75%酒精中浸泡消毒10min，在超净工作台上分离瘤体。取其中生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水冲洗后剪碎，经0.25%胰蛋白酶室温下消化5min，过300目尼龙网制成小鼠Lewis 肺癌无菌单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×107/mL；台盼蓝染色后示:活细胞比例＞95%，取60 只C57BL/6小鼠，将配制好的细胞悬液接种至每只小鼠右腋皮下，每只接种0.2mL。随机分生理盐水组、CTX组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和CTX加中药中剂量组，每组10只。

2.2 给药方法 接种24h 后给药，生理盐水组予生理盐水0.2mL灌胃，1天1次，共14天；中药低、中、高剂量组予相应浓度中药肺金方0.2mL灌胃，1天1次，共14天；CTX 组予CTX 20mg/kg，腹腔内注射，1天1次，第1～5天，同时予生理盐水10mL/kg 灌胃，1天1次，共14天。CTX 加中药组予中药中剂量0.2mL 灌胃，1天1次，共14天，同时给予CTX 20mg/kg，腹腔内注射，1天1次，第1～5天。

2.3 标本采集 灌胃14天后，动物禁食不禁水12h，脱颈处死后，剥取瘤块，10﹪甲醛固定。

2.4 检测小鼠肺部肿瘤转移数 取肺，光镜观测肺转移灶数目。

2.5 瘤块及瘤周围组织VEGF-C、nm23 检测 采用免疫组化SP法，一抗为兔抗鼠单克隆抗体，1∶100 稀释，生物素化二抗为山羊抗小鼠IgG，滴加辣根酶标记链霉卵白素，二甲基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。操作按试剂盒说明书进行，VEGF-C 为肿瘤细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，nm23以细胞膜上出现棕黄色判为阳性。在10×40 倍高倍镜下，每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数≥25%为阳性表达。采集免疫组织化学染色图像，用Image-Pro Plus 分析软件进行图像分析，每张切片随机选取5个视野测定瘤组织中阳性细胞平均光密度。

2.6 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件，计量资料以（）表示，两组间比较用SNK法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 肺金生方对Lewis 肺癌小鼠自发肺转移的影响

除中药低剂量组外，各处理组肺转移数与生理盐水组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；环磷酰胺组、环磷酰胺加中药组与中药各组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；中药中、高剂量组与中药低剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明肺金生方对Lewis肺癌小鼠自发肺转移的影响与其浓度有一定关系，见表1。

表1 各组Lewis肺癌小鼠自发肺转移个数比较（）个

表1 各组Lewis肺癌小鼠自发肺转移个数比较（）个

注：与生理盐水组比较，*P＜0.01；与中药高、中、低剂量组比较，△P＜0.01；与中药低剂量组比较，▲P＜0.01

3.2 肺金生方对Lewis 肺癌移植瘤细胞VEGF-C、nm23蛋白表达的影响 与生理盐水组比较，中药各剂量组及CTX、CTX 加中药组均能降低VEGF-C 表达（P＜0.05、P＜0.01）；中药中、高剂量组、CTX 加中药组均能提高nm23 表达（P＜0.01），中药中、高剂量组的nm23表达又高于CTX加中药组（P＜0.01），见表2。

4 讨论

肺金生方来源于《金匮要略》经典方泽漆汤，方中以泽漆为君，功专消痰行水，人参助泽漆逐水消痰，扶正固本，桂枝、前胡、生姜温阳化饮，降气消痰。人参、甘草健脾以扶正气，佐黄芩以清泄水饮久留所化之郁热，加用蜂房、红豆杉散结消肿，共奏补肺散结，化气消痰，止咳平喘之功。

表2 肺金生方对Lewis肺癌移植瘤细胞VEGF-C、nm23蛋白表达的影响（）

表2 肺金生方对Lewis肺癌移植瘤细胞VEGF-C、nm23蛋白表达的影响（）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与CTX+中药组比较，△P＜0.01

VEGF-C 被认为在肿瘤淋巴道转移中起着重要作用，具有促进淋巴管、血管内皮细胞增生的作用，可通过促进肿瘤新生淋巴管形成及淋巴管扩张，并参与人体多种生理及病理过程[3]。nm23 基因是肿瘤转移抑制基因之一，nm23 基因引起许多哺乳类动物肿瘤细胞过于表达而促进细胞凋亡发生。若nm23缺失，可导致肿瘤细胞的长期存活[4]。本研究结果表明，中药肺金生方各剂量组均能降低VEGF-C 表达（P＜0.01、P＜0.05），而中药肺金生方中、高剂量组、CTX 加中药组均能提高nm23的表达（P＜0.01），中药肺金生方中、高剂量组的nm23表达水平较CTX加中药组更高（P＜0.01）。本组结果表明肺金生方可以抑制Lewis 肺癌小鼠自发肺转移，其机制可能与降低VEGF-C 表达和提高nm23的表达有关，但其确切机制尚待进一步研究。

［1］中华人民共和国卫生部.第三次全国死因调查主要情况［J］.中国肿瘤，2008，17（5）:344-345.

［2］周少玲，庞德湘.肺金生方治疗肺虚痰阻型非小细胞肺癌29例临床观察［J］.浙江中医杂志，2008，43（6）:328-329.

［3］Hirakawa S，Lawence FB，Kodama S，et al.VEGF-C induced lym-phangiog-enesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metasis to distant sites［J］.Blood，2007，109（2）:1010-1017.

［4］侯治富，杨绍娟.基因治疗的研究概况［J］.中国肿瘤临床，1997，24（8）:619.