一种可同时检测小肠推进和吸收的方法

刘健翔，张昕晔，潘冬梅，张琴丽，李向荣

(浙江大学城市学院医学与生命科学学院，浙江 杭州 310015)

推进与吸收是小肠的两个主要功能。目前常采用酚红法、碳末法等来检测小肠的推进速度，其原理很简单。D-木糖法则是评价肠道吸收情况的常用方法，它是基于D-木糖的特点，即体内不产生，吸收后在肝脏不代谢，而以原型由肾脏排泄［1］。然而，在肠道定位给药等研究中，经常需要同时评价小肠的推进速度和吸收情况，这时往往需要两种模型兼用。如果能够在一个动物体同时进行这两项检测，则可大大减少使用动物的数量。本研究以小鼠为实验动物，探索一种胃饲含D-木糖和酚红的混合试剂，以同时评价小肠吸收和推进运动的简便方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组情况 ICR 雄性小鼠60只，浙江省医学科学院动物中心提供，体重18～22 g，每组10 只。小鼠适应性饲养4 d 后随机进行分组，分别为低、中、高剂量(1.25%、2.5%、5%)D-木糖+0.12%酚红混合试剂组、5% D-木糖对照组、0.12%酚红对照组、肠损对照组。其中，肠损对照组小鼠胃饲5%D-木糖高剂量+0.12%酚红溶液。实验前12 h 禁食不禁水，胃饲容量为0.15 ml/10 g。

1.2 试剂 D-木糖(国药集团化学试剂公司，批号:F20060404);酚红(上海三爱思试剂公司);间苯三酚(国药集团化学试剂公司，批号:F20060223);明胶(中国上海试剂总厂，批号:20010620)。

1.3 仪器 Sp-754 型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器公司);HH-4 型恒温水浴锅(江苏亿通分析仪器厂);TXL-2.5 型离心机(成都生科仪器公司)。

1.4 试剂准备

1.4.1 低、中、高剂量混合试剂 称取1.5 g明胶，加水7.5 ml，加入酚红0.12 g，溶胀30 min，待溶胀完全后分别加入D-木糖0.125 g、0.25 g、0.5 g(分别为低、中、高剂量)，加水2.5 ml，60℃水浴溶解，混匀，37℃保温。

1.4.2 5%D-木糖试剂 称取1.5 g 明胶，加水7.5 ml，溶胀30 min 后加入D-木糖0.5 g，加水2.5 ml，60℃水浴溶解，37℃保温。

1.4.3 0.12%酚红试剂 称取1.5 g 明胶，加水7.5 ml 溶胀30 min，取酚红0.12 g，在溶胀过程中加入，溶胀完成后加水2.5 ml，60℃水浴，溶解，37℃保温。

1.4.4 间苯三酚显色剂 间苯三酚1 g，加冰醋酸200 ml，浓盐酸12 ml，溶解混匀。

1.5 血中D-木糖浓度检测 胃饲结束后10 min 时，小鼠眼眶取血0.4 ml，在3 000 r/min 离心40 min，取上清50μl，加水定容至10 ml，加入间苯三酚显色剂5.0 ml，沸水浴加热8 min，流水冷却至室温，放置10 min。高、中、低剂量组以酚红对照试剂灌胃取血样同时处理所得样品为空白;D-木糖对照组以15%明胶试剂灌胃为空白，于554 nm 波长处测定吸光度。

1.6 小肠推进率测定 脱颈椎处死小鼠，沿腹中线剪开腹腔，在腹腔内找到酚红在小肠内推进部位，用丝线结扎后分别于胃幽门处、盲肠下1 cm 处剪断肠道，取出小肠直铺在白纸上，分别测量胃幽门至结扎处距离(AD)和胃幽门至盲肠的小肠总长距离(OD)，以AD/OD 为小肠推进率(%)。

1.7 D-木糖测定标准曲线 显色剂:间苯三酚1 g，加冰醋酸200 ml，浓盐酸12 ml，溶解混匀。称取D-木糖0.3 g，溶解于10 ml 容量瓶中，分别取50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl 加水定容至10 ml，再分别取50μl 与试管中，加入显色剂5.0 ml，沸水浴加热8 min，流水冷却至室温，放置10 min。于554 nm 波长处测定吸光度。

1.8 肠损模型制备 采用快速缺血性夹闭方法制造肠损模型。缺血性夹闭方法:腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。于腹正中线偏右处切开，切一大约0.5 cm×0.6 cm 切口，找到十二指肠，分离肠系膜上动脉丛，用无损伤动脉夹夹闭导致肠缺血，45 min 后松夹，缝合腹腔。

1.9 统计方法 数据统计采用SPSS 13.0，所有统计数据用均值±标准差表示，数据齐性采用单因素方差分析，组间差异显著性进行Student-t 检验，P＜0.05 被认为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 间苯三酚法测定血中D-木糖浓度标准曲线 见图1。血中D-木糖在0.17 mg/ml～1.05 mg/ml 浓度范围内与554 nm 吸光度呈线性相关，相关系数R 为0.9984。

图1 D-木糖测定标准曲线Fig.1 Standard curve of D-xylose assay

2.2 胃饲混合试剂后血中D-木糖浓度 胃饲低、中、高剂量混合试剂(分别含1.25%、2.5%、5% D-木糖与0.12% 酚红、15% 明胶)后，10 min 时低剂量组血中D-木糖浓度为(0.15±0.02)mg/ml，中 剂 量组 为(0.25±0.05)mg/ml，高剂量组为(0.47±0.06)mg/ml。由图2 可见，随着胃饲混合试剂中D-木糖浓度升高，血中D-木糖浓度相应增高，在高剂量组显著高于中剂量组。高剂量混合试剂组血中D-木糖浓度与5% D-木糖对照组［(0.45±0.04)mg/ml］无显著差异(P ＞0.05)。高、中剂量混合试剂组血中D-木糖浓度分别极显著(P＜0.01)和显著(P＜0.05)高于肠损对照组［(0.12±0.03)mg/ml］。

2.3 D-木糖含量对小肠推进率的影响 胃饲15 min 后，低、中、高剂量混合试剂组(分组同2.2)的小肠推进率分别为(64.7±3.8)%、(72.7±7.3)%和(74.7±4.3)%，三组之间的小肠推进率均无显著差异(P ＞0.05)。中、低剂量混合试剂组的小肠推进率与0.12%酚红对照组［(59.0±5.4)%］无显著差异。由图3可见，随着混合试剂中D-木糖浓度的递增，小肠的酚红推进率有增加的趋势，高剂量D-木糖组酚红的小肠推进率显著(P＜0.05)高于酚红对照组。在中、高剂量D-木糖组，小肠推进率均显著(P＜0.05)高于肠损对照组［(54.1±5.8)%］。

图2 胃饲含不同剂量D-木糖的混合试剂10 min 后，血中D-木糖浓度Fig.2 Serum concentration of D-xylose at 10 min after i.g.administration of mixed reagent containing different doses of Dxylose

图3 胃饲含不同剂量D-木糖的混合试剂15 min 后小肠的推进率Fig.3 Small intestine propulsion rate at 15 min after i.g.administration of mixed reagent containing different doses of D-xylose

3 讨论

本研究结合两种常用的检测方法，对同一只动物胃饲混合试剂，再分别用D-木糖法检测小肠吸收能力，用酚红法检测小肠推进情况。该方法尚未见文献报道。

在预实验中发现，小鼠胃饲酚红和D-木糖的混合试剂15 min 后，酚红在肠道内的推进率接近100%，方法学价值较低。为了减慢混合试剂的推进速度，我们加入一定浓度的明胶，将整个混合检测试剂制成较黏稠的混悬液。但是，明胶在溶胀浓度达到20% 时已经完全饱和，整个明胶体系成为果冻状的半固体，无法用以给小鼠定量灌胃。比较加入15%和10%明胶的效果发现，胃饲含10%明胶的混合试剂，在20 min 时推进率接近90%，在25 min 时接近100%，即将进入大肠;而胃饲含15%明胶的混合试剂，在20 min 时小肠推进率约为75%，在25 min 时约为85%，比较符合观察的需要。因此确定在混合试剂中加入15%的明胶，以控制推进率。

胃饲给药时，胃的扩张刺激可能通过胃肠反射等影响小肠推进率，因此给药容量也是一个重要参数。预实验发现胃饲0.25 ml/10 g 的混合试剂后，小肠推进率显著高于胃饲0.15ml/10g 的小鼠，因此采用后者。另外，饥饿可使消化道蠕动加快，为减少这一因素的影响，本实验要求对小鼠统一禁食不禁水12 h。此外，小肠蠕动可能受到昼夜节律的影响，因此本实验各组在上午9 时同时开始胃饲。

为减少混合试剂中各种成分对检测结果的可能影响，还需要确定其他参数。预实验发现灌胃10 min、15 min 都可以在血中检测到D-木糖。随着吸收时间的增加，血液中D-木糖的浓度也增加，说明D-木糖在小肠内的吸收十分迅速。考虑到灌胃20 min 后小肠推进率已近3/4，故选择胃饲10 min 后即取血测定。

目前血液中D-木糖的检测可采用HPLC法［2］，该法准确可靠，但是对仪器设备等条件要求较高。本实验用间苯三酚为显色剂，在554 nm 波长检测D-木糖在血液中的浓度。由图1 标准曲线可见，线性回归相关系数达到0.9984。可见，间苯三酚法操作简单、成本较低，而且检测结果准确，可以应用。

已有文献报道，在沸水浴反应4 min 后，葡萄糖、果糖、D-木糖等糖类，以间苯三酚为显色剂，在554 nm 波长下有吸收［3］。D-木糖在554 nm 的吸收大大强于葡萄糖、果糖等，且有较好的分离度。由于在沸水中加热4 min，间苯三酚与血中D-木糖的反应不完全，吸收效果不佳。在延长沸水浴加热时间后，D-木糖吸收有明显增加，在8 min［4］左右D-木糖与显色剂基本完全反应，并且此时血中葡萄糖的吸收依然较低，不会对D-木糖吸收产生明显影响。综合考虑以上情况，本法最终选定沸水浴时间为8 min。

一般认为酚红在肠道内不吸收，因而采用酚红作为标志用于判断肠道推进功能。但酚红在混合试剂内含量不能太高，否则试剂会由均匀的混悬液直接沉降析出，结成团块状，这样就无法定量给小鼠灌胃，不利于快速检测。经过预实验，0.12%的酚红含量相对比较合适，整个混悬液能保持均一稳定。该混和试剂在小肠内推进时，剖开腹腔可以很明显分辨出酚红推进情况。但是，胡一桥等人［5］在对离子型药物酚红的研究中发现，酚红在小肠内实际上有少量吸收，血中因为酚红的存在而有一定的吸光度。我们预实验也证实了这一点，因此本研究设酚红对照组，以此排除小肠内酚红吸收对结果带来的可能影响。

从图2 可见，胃饲混合试剂后，血中D-木糖浓度可以灵敏地反映小肠的吸收功能，而混合试剂中酚红等其他成分并未影响D-木糖的吸收。从图3 可见，D-木糖的加入可能增加了酚红的小肠推进率，这一现象需要进一步研究。在实际应用时，可考虑适当调低混合试剂中D-木糖的含量，以减少D-木糖对小肠推进的影响，也可以增设相应的对照组进行比较。

从图2 和图3 还可看出，肠损对照组动物的小肠吸收能力明显低于对照，而肠损对小肠推进的影响并不明显，提示消化道缺血损伤主要影响小肠吸收功能。

综上所述，采用含有0.12%酚红、5%D-木糖和15%明胶的混合试剂，按0.15ml/10g 的容量胃饲小鼠，10 min 后取血用间苯三酚法测定D-木糖浓度，15 min 后取小肠测定酚红推进率，可快速、准确地同时检测小肠的吸收和推进，成本低廉，结果可靠，便于应用。两种方法的合并可减少动物用量和动物个体差异，也为研究小肠推进和吸收的关系提供了一种新模型。

［1］SHENG W，LI M(盛 惟，黎 明).The evaluation of xylose absorption experiment ［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research(时珍国医国药)，2001，12(2):112-113.(in Chinese)

［2］LIU F N，LUO N，TAN L(刘放南，罗楠，谭 力).The measurement of D-xylose normal range of blood and urine of healthy volunteers using HPLC after Dxylose absorption testing ［J］.Parenteral ＆Enteral Nutrition(肠外与肠内营养)，2004，11(3):184-186.(in Chinese)

［3］EBERTS T J，SAMPLE R H B，GLICK M R.A simplified，colorimetric micromethod for xylose in serum or urine，with phloroglucinol ［J］.Clin Chemistry，1979，25(8):1440-1443.

［4］LI J Y，SUN D(黎君友，孙 丹).Experimental study of gut absorptive capacity after trauma detected D-xylose content test with micromethod［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation(中国临床康复)，2003，20(8):2810-2811.(in Chinese)

［5］HU Y Q，ZHENG L Y，QIAN C Q(胡一桥，郑粱元，钱陈钦).Absorption of phenol red from rat intestine［J］.Journal of China Pharmaceutical University(中国药科大学学报)，1996，27(6):355-359.(in Chinese)