Toll样受体4在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

满晓华 孙运良 龚燕芳 吴红玉 李兆申

·论著·

Toll样受体4在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

满晓华 孙运良 龚燕芳 吴红玉 李兆申

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组化SP法检测62例经病理证实的胰腺癌手术切除标本及35例癌旁正常胰腺组织中TLR4蛋白表达，采用CD31抗体标记微血管内皮细胞，计算微血管密度(MVD)。分析TLR4蛋白表达与胰腺癌临床病理特征以及MVD的相关性。结果胰腺癌组织TLR4蛋白阳性表达率和MVD分别为74.2%(46/62)和47.3±13.5，均显著高于正常胰腺组织的17.1%(6/35)和12.6±4.8(P值均<0.01)。有淋巴结转移的胰腺癌组织中TLR4蛋白阳性表达率为83.8%，显著高于无淋巴结转移的60.0%(P=0.036)；TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期的胰腺癌组织中TLR4蛋白阳性表达率为85.3%，显著高于Ⅰ+Ⅱ期的60.7%(P=0.028)。MVD与肿瘤的大小、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P值分别为0.008、0.036、0.010)。胰腺癌TLR4蛋白表达与MVD呈显著正相关(γ=0.534，P<0.01)。结论TLR4参与胰腺癌的发生、发展，其机制可能与促进肿瘤血管生成有关。

Toll样受体4； 胰腺肿瘤； 血管生成，病理性； 免疫组织化学

Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是最早发现的、同时也是研究最为广泛的TLR家族成员。近年来研究发现，TLR4在多种肿瘤细胞中呈高表达，参与了肿瘤的发生与发展[1]。本研究检测胰腺癌组织的TLR4蛋白表达，分析其与胰腺癌临床病理特征及微血管密度(microvessel density，MVD)的关系，探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用。

材料和方法

一、标本来源

收集2006年1月至2010年12月长海医院手术切除并经病理证实且资料完整的胰腺导管腺癌标本62例，所有患者手术前均无化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。另选择35例距肿瘤5 cm以上且经病理证实为正常胰腺的癌旁组织标本作为对照。

二、TLR4及MVD检测

采用免疫组化染色超敏两步法(SP染色法)，按SP免疫组化试剂盒(福州市迈新生物技术开发公司)说明书操作。兔抗人TLR4多抗(Santa Cruz公司)工作浓度1∶200，小鼠抗人CD31单抗(Neo makers公司)工作浓度1∶100。用已知TLR4表达强阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作阴性对照。

TLR4阳性染色为胞膜和胞质出现棕黄色颗粒。采用双盲法随机观察5个高倍视野。评分标准：阳性细胞率≤5%为0分，6%～29%为1分，30%～59%为2分，≥60%为3分；无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两分相乘，≤1分为阴性，2分为弱阳性，3～4分为中等度阳性，≥5分为强阳性。

CD31主要表达于血管内皮细胞膜，任何被染成棕色的血管内皮细胞或细胞簇均作为一个血管计数，只要结构不相连,其分支结构也作为一个血管计数,厚壁血管或管径>50 μm的血管则排除在外。先在低倍镜下选择血管密集区，然后高倍镜下随机计数5个视野内微血管数，取其均值为MVD。

三、统计学方法

结 果

一、胰腺癌与癌旁组织TLR4表达及MVD

癌旁正常胰腺组织TLR4表达阴性29例，弱阳性5例，中等度阳性1例，阳性表达率为17.1%；胰腺癌组织TLR4表达阴性16例，弱阳性9例，中等度阳性22例，强阳性15例，阳性表达率为74.2%(图1)，两者差异具有统计学意义(P<0.01)。

肿瘤组织最密集血管染色区域主要位于癌灶边缘(图2)。胰腺癌组织MVD为47.3±13.5，显著高于癌旁组织的12.6±4.8(P<0.01)。

图1 胰腺癌(a)和癌旁组织(b)TLR4表达(SP ×400)

图2 胰腺癌(a)和癌旁组织(b)CD31表达(SP ×200)

二、TLR4表达、MVD与胰腺癌临床病理特征的关系

胰腺癌组织TLR4表达与胰腺癌患者的年龄、性别及肿瘤部位、大小、分化程度均无关，而与淋巴结转移、TNM分期相关。MVD与胰腺癌患者的年龄、性别及肿瘤部位、分化程度均无关，而与肿瘤的大小、淋巴结转移及TNM分期相关(表1)。

表1 TLR4表达、MVD与胰腺癌临床病理特征的关系

三、胰腺癌组织TLR4表达与MVD的相关性

胰腺癌组织TLR4表达阴性、弱阳性、中等度阳性和强阳性组的MVD分别为36.4±6.9、47.4±13.6、48.4±11.9和57.2±13.5，组间差异有统计学意义(F=8.521，P<0.01)。TLR4表达与MVD呈显著正相关(γ=0.534，P<0.01，图3)。

图3 胰腺癌组织TLR4表达和MVD的相关性

讨 论

TLRs是近年来发现的I型跨膜蛋白质,它通过识别病原相关的分子模式及某些内源性配体引发信号转导，引起炎症介质的释放，被公认为天然免疫系统中最重要的一类受体家族，其中TLR4是目前研究相对较为成熟的TLR家族成员。TLR4除了在免疫细胞表达外，还在肿瘤细胞高表达，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[2]。Szajnik等[3]报道，TLR4在卵巢癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。Wang等[4]报道，TLR4在结肠癌组织中呈显著高表达，且与肝转移及肿瘤的TNM分期密切相关。本研究结果也显示，胰腺癌组织TLR4高表达，且与胰腺癌的TNM分期以及淋巴结转移密切相关，提示TLR4在胰腺癌的发生与发展中起着重要的作用。

实体肿瘤的生长需要血管来提供营养和排泄自身代谢产物。当肿瘤体积<1 mm3时，这一过程可通过组织渗透来完成；随着瘤体的增大，肿瘤本身或宿主组织将建立新生血管网以供给瘤体营养。Riddell等[5]报道，TLR4被激活后可调控VEGF的表达，促进血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，导致血管生成增加。本结果显示，胰腺癌组织MVD显著高于正常胰腺组织，MVD与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移密切相关，且TLR4表达和MVD呈显著正相关，提示TLR4可能通过促进肿瘤血管的生成参与胰腺癌的发生和发展过程。

[1] Ghaneh P, Costello E, Neoptolemos JP. Biology and management of pancreatic cancer. Postgrad Med J, 2008, 84:478-497.

[2] Rakoff-Nahoum S, Medzhitov R.Toll-like receptors and cancer. Nat Rev Cancer, 2009, 9:57-63.

[3] Szajnik M,Szczepanski MJ,Czystowska M,et al.TLR4 signaling induced by lipopolysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer.Oncogene,2009,28:4353-4363.

[4] Wang EL,Qian ZR,Nakasono M,et al.High expression of Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88 signals correlates with poor prognosis in colorectal cancer.Br J Cancer,2010,102:908-915.

[5] Riddell JR,Bshara W,Moser MT,et al.Peroxiredoxin 1 controls prostate cancer growth through Toll-like receptor 4-dependent regulation of tumor vasculature.Cancer Res,2011,71:1637-1646.

RelationshipbetweenTLR4expressionandangiogenesisinhumanpancreaticadenocarcinoma

MANXiao-hua,SUNYun-liang,GONGYan-fang,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate Toll-like receptor-4(TLR4) protein expression in human pancreatic adenocarcinoma, and to evaluate the relationship between TLR4 protein expression and angiogenesis.MethodsSixty-two surgically resected human pancreatic adenocarcinoma specimens and 35 normal para-cancerous tissues were investigated for TLR4 protein expression by immunohistochemical SP methods, and CD31antibody was used to mark microvascular endothelial cells and determine the microvessel density (MVD). The correlation among TLR4 protein expression and MVD and clinicopathologic features of pancreatic adenocarcinoma were analyzed.ResultsTLR4 protein positive expression rate and MVD in human pancreatic adenocarcinoma was 74.2%(46/62) and 47.3±13.5, respectively, which were significantly higher than those in the normal pancreatic tissue [17.1%(6/35), 12.6±4.8;P<0.01]. TLR4 protein positive expression rate in the cases with lymph node metastasis was 83.8%, which was significantly higher than that in the cases without lymph node metastasis (60.0%,P=0.036). TLR4 protein positive expression rate in the patients with stage III and IV of TNM classification was 85.3%, which was significantly higher than that in the patients with stage I and II (60.7%,P=0.028). MVD was closely related to tumor size, lymph node metastasis and TNM stage of pancreatic adenocarcinoma (P=0.008, 0.036, 0.010). There was a strong positive correlation between TLR4 protein expression and MVD (r=0.534,P<0.01).ConclusionsTLR4 protein expression is closely related to the development and progression of human pancreatic adenocarcinoma and its potential mechanism is related to the promotion of tumor angiogenesis.

Toll-like receptor 4; Pancreatic neoplasms; Angiogenesis, pathologic; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.008

210043 上海，第二军医大学长海医院消化内科(满晓华、龚燕芳、吴红玉、李兆申)；江苏省赣榆县人民医院消化内科(孙运良)

共同第一作者：孙运良

李兆申，Email：zhsli@81890.net

2011-12-20)

(本文编辑：屠振兴)