DLL4在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

徐桂芳 张伟杰 孙琦 杨军 周志华 赵海滨 邹晓平

·论著·

DLL4在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

徐桂芳 张伟杰 孙琦 杨军 周志华 赵海滨 邹晓平

目的检测delta-like ligand 4(DLL4)在胰腺癌中的表达，分析其与肿瘤血管生成及临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测60例胰腺癌组织及20例癌旁正常胰腺组织中DLL4的表达；观察微血管内皮细胞CD34表达,计算微血管密度(MVD)；分析DLL4表达、MVD与胰腺癌临床病理特征之间的关系以及两者的相关性。结果DLL4在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织(68.3%比20.0%,P<0.01)；胰腺癌组织DLL4的高表达与肿瘤分化程度、TNM分型、肿瘤转移及浸润等呈正相关(P值均<0.05),而与肿瘤部位、大小、组织病理分型无关。胰腺癌组织MVD明显高于正常胰腺组织(34.9±13.2比18.9±2.2,P<0.01)；胰腺癌的MVD与肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤转移及浸润有关(P值均<0.05)，而与肿瘤部位、大小、组织病理分型等无明显相关性。DLL4表达阳性的胰腺癌组织MVD明显高于DLL4表达阴性者(38.8±10.7比29.0±15.2,P<0.05)，且DLL4表达与MVD呈显著正相关(r=0.669,P<0.05)。结论DLL4表达可促进肿瘤血管生成,且与胰腺癌的转移、浸润相关。

胰腺肿瘤; DLL4; 微血管密度; 淋巴结; 肿瘤转移; 免疫组织化学

Notch信号途径是由多种分子参与的复杂信号转导通路, 通过调节相邻细胞之间信号转导进而调控细胞发育。在哺乳动物细胞中，Notch信号通路包含5种跨膜Notch配体[Jagged1、2及Delta-like ligand(DLL)1、3、4]和4种Notch受体(Notch1、2、3、4)[1]。其中DLL4作为内皮细胞特异性配体,在血管的新生、发育和成熟过程中起主要作用[2]。本研究检测胰腺癌组织DLL4表达，探讨其与微血管密度(microvessel density, MVD)及胰腺癌病理特征的相关性。

材料和方法

一、研究对象

收集南京鼓楼医院2000年10月至2002年8月手术切除的胰腺癌标本60例,其中男性42例,女性18例；年龄39～72岁，中位年龄63岁。另取其中20例切除远端的正常胰腺组织作为对照。病理诊断与分类依据国际抗癌联合会的TNM临床分类。

二、DLL4蛋白及MVD检测

采用免疫组化染色法，按SP超敏试剂盒(KIT29709，福州迈新生物技术开发公司)说明书操作。兔抗人DLL4多抗及CD34单抗购自Abcam公司，工作浓度1∶100；二氨联苯胺(diaminobenzidine，DAB)酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。用PBS替代一抗作阴性对照。由两位病理科医师双盲法阅片，每张切片选取5个400倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，胞质中出现棕黄色颗粒为DLL4阳性染色，阳性细胞数<10%为阴性，≥10%为阳性表达。

CD34表达于血管内皮细胞膜,每一个染成棕黄色的、可与周围血管和肿瘤细胞及其他结缔组织区分开来的明显微小血管腔或含3个以上内皮细胞的内皮细胞簇,不论管腔和红细胞出现与否,均作为一个单一的、可计数的微血管。管腔面积>8个红细胞直径,带有较厚肌层的微血管均不计数[3]。先于低倍镜下确定3个血管着色最密集区域,然后在100倍视野下计数3个视野的微血管数目,取均值作为MVD。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌及正常胰腺组织DLL4的表达

胰腺癌组织DLL4的表达率为68.3%(41/60),正常胰腺的表达率为20.0%(4/20)，两者差异具有统计学意义(P=0.000，图1)。胰腺癌DLL4表达与患者性别、年龄及肿瘤部位、大小、组织病理分型均无关，而与肿瘤分化程度、TNM分型、肿瘤转移及浸润等呈正相关(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺癌及正常胰腺组织的MVD

60例胰腺癌组织的MVD为34.9±13.2,正常胰腺组织为18.9±2.2，两者差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。MVD与胰腺癌的肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤转移及浸润均有关(P<0.05)。而与患者性别、年龄及肿瘤部位、大小、组织病理分型等均无关(表1)。

图1 胰腺癌(a)与正常胰腺组织(b)DLL4表达(×400)

图2 胰腺癌(a)与正常胰腺组织(b)的MVD(×400)

表1胰腺癌组织DLL4表达、MVD与临床病理特征的关系

病理特征例数DLL4阳性[例,率(%)]P值MVD(x±s)P值年龄(岁)0.5280.797 <602818(64.3)33.8±12.6 ≥603223(71.9)35.9±12.9性别0.2110.122 男3421(61.8)34.1±12.1 女2620(76.9)36.0±14.7肿瘤部位0.0950.360 胰头5137(72.5)35.0±12.6 胰体尾94(44.4)34.3±17.1分化程度0.0220.049 低分化2219(86.4)42.9±8.7 中高分化3822(57.9)30.2±13.2组织病理分型0.1100.329 导管细胞腺癌5135(68.6)35.7±13.5 乳头状腺癌75(71.4)31.0±12.1 其他类型癌21(50.0)28.0±7.7肿瘤大小(cm)0.0710.650 ≤2.5115(45.5)31.8±13.1 >2.54936(73.5)35.6±13.2肿瘤累及范围0.0070.046 T1～T22915(51.7)23.8±4.9 T3～T43126(83.9)45.3±9.4淋巴结转移0.0130.045 N02412(50.0)29.3±9.8 N13629(80.6)38.6±13.9TNM临床分期0.0340.038 Ⅰ～Ⅱ2312(52.2)25.0±7.9 Ⅲ～Ⅳ3729(78.4)41.1±12.0

三、胰腺癌组织DLL4表达与MVD的相关性

DLL4表达阳性的胰腺癌组织的MVD为38.8±10.7，DLL4表达阴性的胰腺癌组织的MVD为29.0±15.2，差异具有统计学意义(P=0.038)。胰腺癌组织DLL4表达与MVD呈显著正相关(r=0.669,P<0.05)。

讨 论

文献报道，血管内皮细胞表达Notch1和Notch4受体及jagged1、DLL1和DLL4配体，且肿瘤血管和肿瘤细胞中也高表达DLL4，并活化Notch信号[4-5]。本结果显示，胰腺癌组织高表达DLL4， DLL4的过表达与胰腺癌的侵袭和转移呈正相关，提示DLL4高表达与胰腺癌的恶性生物学行为密切相关。

MVD是衡量血管生成的定量指标。Ikeda等[6]报道，MVD可作为胰腺癌临床病理改变的独立预后因素。章福彬等[7]报道，MVD与临床病理特征关系密切，且与疾病进展阶段呈正相关。本结果显示，胰腺癌MVD明显高于正常胰腺组织，且与胰腺癌的浸润、转移相关，同样提示MVD与胰腺癌的恶性生物学行为密切相关。本结果还显示，DLL4高表达与肿瘤组织MVD呈显著正相关，表明DLL4的表达参与胰腺癌的血管生成过程。

文献报道，抑制肿瘤组织中DLL4的过度表达将导致肿瘤组织生成大量无功能的新生血管，造成肿瘤组织血供不足，最终导致肿瘤生长受到抑制[8]。抗DLL4抗体也可以特异性阻断Notch信号通路，抑制小鼠肿瘤生长。因此，DLL4现已经成为肿瘤抗血管治疗研究的新热点。以DLL4为靶目标的抗血管治疗技术将为胰腺癌的综合治疗提供新的方法。

[1] Radtke F, Schweisguth F, Pear W. The Notch ‘gospel’. EMBO Rep, 2005, 6:1120-1125.

[2] Schuch G, Kisker O, Atala A, et al. Pancreatic tumor growth is regulated by the balance between positive and negative modulators of angiogenesis. Angiogenesis, 2002,5:181-190.

[3] Boxer GM, Tsiompanou E, Levine T, et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor and microvessel counting as prognostic indicators in node-negative colorectal cancer. Tumour Biol, 2005, 26: 1-8.

[4] Patel NS, Li JL, Generali D, et al. Up-regulation of delta-like 4 ligand in human tumor vasculature and the role of basal expression in endothelial cell function. Cancer Res, 2005, 65: 8690-8697.

[5] Yan XQ, Sarmiento U, Sun Y, et al. A novel Notch ligand, Dll4, induces T-cell leukemia/lymphoma when overexpressed in mice when over expressed by retroviral mediated gene transfer. Blood, 2001,98: 3793-3799.

[6] Ikeda N, Adachi M, Taki T, et al. Prognostic significance of angiogenesis in human pancreatic cancer. Br J Cancer,1999,79:1553-1563.

[7] 章福彬，朱斌，邵成浩.胰腺导管癌组织中VEGF表达和肿瘤微血管计数的临床意义.解放军医学杂志,2005,30:159-161.

[8] Noguera-Troise I, Daly C, Papadopoulos NJ, et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis. Nature,2006,444: 1032-1037.

Expressionofdeltalikeligand4inpancreaticcanceranditsrelationshipwithangiogenesis

XUGui-fang,ZHANGWei-jie,SUNQi,YANGJun,ZHOUZhi-hua,ZHAOHai-bin,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital，NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo detect the expression of delta-like ligand 4(DLL4) and its relation with the angiogenesis in pancreatic cancer.MethodsSP immunohistochemistry method was used to detect the expression of DLL4 in pancreatic cancer and para-cancerous tissue. The microvessel density (MVD) was calculated with CD34staining for microvessel endothelium and the correlation between expression of DLL4, MVD and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in para-cancerous normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was positively related to the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not related to the location, tumor size and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in para-cancerous normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated with the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not with the tumor size and location, histological types. MVD in pancreatic cancer expressing DLL4 was significantly higher than that in pancreatic cancer not expressing DLL4 (38.8±10.7vs29.0±15.2,P=0.038), and the expression of DLL4 and MVD were positively correlated (r=0.669,P<0.05).ConclusionsDLL4 expression may play an important role in pancreatic carcinogenesis by promoting angiogenesis and may be associated with tumor invasion and metastasis.

Pancreatic neoplasm; Delta-like ligand 4; Microvessel density; Lymph nodes; Neoplasm metastasis; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.007

南京大学中央高校科研资助项目(021414340038)；南京市青年基金项目(QYK11166)；南京市卫生青年人才培养工程(宁卫科[2011]32号)

210008 南京，南京大学医学院附属鼓楼医院消化科(徐桂芳、邹晓平)，科技处(张伟杰)，病理科(孙琦、杨军)；解放军第101医院病理科(周志华、赵海滨)

邹晓平，Email: zouxiaoping795@hotmail.com

2011-10-13)

(本文编辑：吕芳萍)