时间分辨荧光免疫分析法检测游离F-βHCG的方法学评价

郭翀，李白霞，张真铭，王玉明

时间分辨荧光免疫分析法检测游离F-βHCG的方法学评价

郭翀，李白霞，张真铭，王玉明

（昆明医科大学第一附属医院检验科，云南昆明650032）

目的对时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）定量检测F-βHCG的各种性能指标进行方法学评价,验证其临床适用性。方法通过灵敏度、批内和批间精密度、标准曲线稳定性参数等指标评价TRFIA检测F-βHCG的性能，同时通过回收试验分析其准确度。结果F-βHCG的最小测定值为0.09ng/ml，低、中、高3种质控品批内和批间变异系数均小于10%，标准曲线稳定性参数各变异系数小于5%，回收试验结果在97%～104.7%之间。结论TRFIA法检测F-βHCG具有准确性好、灵敏度高、特异性强、能自动化分析等优点，能充分满足临床检测的需求。

时间分辨；免疫分析；F-βHCG；方法学评价

随着生物标记技术的不断发展，免疫分析技术有了长足的进步。表现为免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射免疫技术转变。在此期间，涌现了一大批非放射免疫技术，时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)正是这类非放射免疫技术的一个典型代表[1]。

HCG是由合体滋养细胞分泌的水溶性糖蛋白激素，其分子的a、β链（亚单位）通过电荷和离子键的相互作用结合在一起。由于两个亚基有多个低聚糖分子侧链，构成了HCG分子结构的不均性，因此人血液中HCG有多种变异体：整分子HCG、多糖基化HCG、缺口HCG、丢失β亚基c端肽HCG、游离a亚基和游离β亚基HCG（F-βHCG）等[2]。妊娠早期，HCG的浓度迅速增高，监测尿中的HCG即可证实妊娠[3]。另外，HCG的含量与许多异位HCG表达的肿瘤有密切关系，可将HCG看作是相关的肿瘤标志物之一[4]，因此，HCG的检查不仅对早孕检测具有重要意义，而且可对滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤的诊断与鉴定诊断提供依据。并且，F-βHCG作为唐氏综合征筛查项目之一，要求其检测方法具有较高的准确性、灵敏度和特异性。本研究对TRFIA法检测F-βHCG的精密度、灵敏度、特异性、回收率等性能指标进行了评估，以期进一步验证TRFIA法检测F-βHCG的临床适用性。

材料和方法

一、材料

1．仪器和试剂：时间分辨荧光免疫分析仪（1235 AutoDelfia，PerkinElmer），F-βHCG试剂盒（PerkinElmer），F-βHCG试剂盒。

2．质控标本blank“O”为男性血清。质控品为所收集的病人血清混合制成，分为低、中、高3种水平，以化学发光法测得β-HCG的值为依据，分类如下：低值质控（β-HCG值﹤10.0U/L）、中值质控（β-HCG值1 000.0～3 000.0 U/L）、高值质控（β-HCG值﹥10 000.0 U/L）。质控血清经少量分装，-20℃冷冻保存。标准品由F-βHCG检测试剂盒提供。

3．研究对象150例孕妇血清标本。

二、方法

1．标准曲线：分别测定六个标准品浓度，标准曲线采用平滑样条曲线（SPLINE SMOOTHED）函数拟合，X-AXIS：LOG，Y-AXIS:LOG-B

2．灵敏度：用blank“O”血清对β-HCG标准品（2.4ng/ml)进行稀释，稀释梯度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，制成7个待测样品进行F-βHCG实验。

3．精密度：用低、中、高值3种质控血清分别进行批内和批间精密度实验，重复次数为20次，并对测定结果和标准曲线的斜率（slope）、有效剂量值（effective dose,ED）20、ED50、ED80等指标进行统计分析。

4．准确性：在浓度为20.83ug/L的血清内分别加入低、中、高值的标准品，制成3个待测样品，进行回收实验。

5．特异性（交叉试验）：将AFP、CEA配成500ug/L的浓度，用F-βHCG试剂盒进行测定，了解与F-βHCG有无交叉反应。

6．线性范围：一高值血清，用blank 0按 1/10的比例稀释，各测定3次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，与实际测定值比较进行线性分析。

7．相关性实验：分别用本法和PerkinElmer Wallac公司生产的试剂盒同时测定50例高、中、低值的样本，进行线性回归分析。

8．统计分析：应用SPSS17.0统计软件包进行数据整理和统计分析，α＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、标准曲线见图1。

二、灵敏度结果如表1所示。

F-βHCG试剂盒使用说明书提示F-βHCG的最低检测限应不大于0.2ng/ml，结合说明书上灵敏度的变异系数应小于15.0%，所以本实验室检测条件下该试剂盒检测F-βHCG的最小测定值为0.09ng/ml。这与相关类似报道结果相符合[1]。

三、精密度结果精密度测试结果见表2，标准曲线稳定性测试结果见表3。

本研究结果表明，低、中、高3种质控样品批内和批间变异系数均小于10%，标准曲线稳定性各参数(slope、ED20、ED50、ED80)变异系数也均小于5%，提示系统精度和稳定性均较高。

图1 标准曲线

表1 F-βHCG灵敏度测试结果（n=20)

表2 精密度测试结果（n=20）

表3 标准曲线稳定性度测试结果（n=20）

四、准确度测试结果回收实验测试系统准确度的结果如表4。

五、特异性试验当AFP、CEA在500μg/L浓度条件下，F-βHCG的检测结果均小于0.09ng/ml。

六、线性实验结果见表5。

当浓度上限为320ng/ml时回归方程为：Y＝0.967X+1.482，r＝0.999；浓度上限为360ng/ml时回归方程为：Y＝1.023X-5.381，r＝0.994；浓度上限为400ng/ml时回归方程为：Y＝1.106X-13.758，r＝0.968。说明本法在320ng/ml范围以内内线性良好。

七、相关性分析相关性分析见图2。

回收实验结果表明系统测试准确度较高。用上述两种方法对150份受检血清进行F-βHCG定量分析，测定结果作相关性分析，结果表明，两种方法差异无显著性（P＞0.05），直线回归方程为：Y（铂金埃尔默）＝0.982X（新波）+0.349，r＝0.988，两法呈正相关。

讨论

目前随着先进技术的迅猛发展，各种诊断试验（包括诊断设备、试剂、方法等）层出不穷，临床实验室开展的检验项目也越来越多。并形成各种组合，但并不是每一种诊断试验肯定比常规或旧试验好。有时同一检验项目有不同的检测系统，但不同检测系统测定检验项目时的分析性能和检验项目在临床诊疗过程中的作用在检验文献中探讨不深入。有的甚至很模糊。厂商为了销售也是夸大其词，再加管理上的欠缺，导致了检验项目的滥用，浪费了很多的人力和物力，也影响了检验医学在临床医学中的地位。

时间分辨荧光免疫分析技术是一种利用稀土离子及其螯合物作为示踪剂的灵敏度高、线性范围宽、应用范围广的非放射性标记免疫分析技术。为了进一步将这一先进超微量物质检验技术推广于临床应用，根据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制订的临床评价方案，对国产的时间分辨荧光免疫法检测F-βHCG试剂盒制订了临床实验方法和评价方案。结果表明该试剂可操作性强，结果可信,经济适用，可作为同类检验仪器和方法学进行临床实验的参考。

时间分辨荧光免疫分析技术，具有灵敏度高，重复性好，标准曲线动态范围宽，标记物存储时间长等优点[5]，同时由于时间分辨荧光免疫分析系统采用波长分辨和时间分辨等方法，提高了系统的探测灵敏度和探测特异性，真正实现了近似零本底测量，从而大大减少了检测系统的系统误差，有效地提高了探测精度。时间分辩荧光免疫分析法检测F-βHCG具有本底低，特异性强，标记物存放时间长，可重复多次检测，重复性好，标准曲线稳定性高，可全自动化操作等优点。其灵敏度、特异性、准确度等性能指标，均符合统计学要求，而且我们采用的β-HCG-TRFIA分析系统由于其高度自动化，能有效提高临床大样本量检验结果的速度，大幅度降低人为误差，增加检出结果的可靠性，对整个妊娠过程的临床诊断、治疗及预后评判起到更好的指导作用。因此时间分辨荧光免疫分析法是定量检测β-HCG的优秀方法。

表4 准确度测试（回收试验）结果

表5 线性实验

［1］秦卫仕,田蓉.时间分辨荧光免疫分析方法学评价[J]．免疫学杂志,2002,18（5）：397-399.

［2］黄树峰.人绒毛膜促性腺激素测定在妇产科中的应用[J]．中华妇幼临床医学杂志,2006,2（3）：172-174.

［3］杨廷富.人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展[J]．检验医学与临床,2007,10（4）：976-978.

［4］ACEVEDO HF,TONG JY,HARTSOCK RJ.Human chorionic gonadotropin beta subunit gene expression in culture human fetal and cancer cells of different types and origin[J]．Cancer,1995,76(8):1467-1475.

［5］仝文斌，滔其敏.自动化免疫分析的进展[J]．中华医学检验杂志,1996,19(4)：329-330.

Evaluation of the methodology of the time-resolved fluoroimmunoassay in F-βHCG measurements.

GUO Chong,LI Bai-xia,ZHANG Zhen-ming,et al.
(Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of KunmingMedical College,Yunnan,Kunming650032,China)

ObjectiveThe methodology of time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA)that detected F-βHCG was evaluated by quantitative assay.MethodsThe functional sensitivity of free β-HCG,imprecision of extra-assay and intra-assaywere tested with free β-HCG assay.The recoverytests were performed byquantitative assay with free β-HCG assay.ResultsThe functional sensitivity of the free β-HCG assay was 0.09ng/ml.The extra-assay cv% and the intra-assay cv%were smaller than 10%,and approved that the stability parameter various coefficient of variation was also smaller than 5%.The recycling experiment result was 97%～104.7%.ConclusionIt is concluded that the methodology of time-resolved fluoroimmunoassay offers many benefits in sensitivity,precision,accuracy, reliabilityand practicability.

Time-resolved；Immunoassay；F-βHCG；Methodology

R446.6

A

1006-4141（2012）04-0352-04

2012－06－08

郭翀（1977～）男，1997年毕业于昆明医学院，主管检验师。