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人食管癌间充质干细胞对食管癌细胞株Eca-109侵袭性的影响

2012-11-06朱孝中刘德森俞力超胡嘉波王晓慧

实用临床医药杂志 2012年22期
关键词:共培养充质细胞株

朱孝中,刘德森,俞力超,胡嘉波,王晓慧

(1.江苏大学附属医院胸外科,江苏镇江,212001;2.江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江,212013)

间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中。近来研究[1-2]显示间充质干细胞可被肿瘤细胞释放的生长因子、细胞因子等生物信号募集至肿瘤组织,与肿瘤组织相互作用,分化形成微环境中各种基质细胞,参与调节肿瘤细胞的生长、侵袭和转移行为。本研究拟从食管癌及癌旁组织中分离和纯化出食管癌间充质干细胞,并将其与食管癌细胞株Eca-109共培养,探讨间充质干细胞对食管癌细胞株侵袭性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清(FBS)、低糖细胞培养基(DMEM)、Trizol试剂(Invitrogen公司),Ⅳ型胶原酶(Sigma公司),青霉素和链霉素(华北制药公司),氟康唑(江苏济川制药公司),RT-PCR成套试剂盒(MMLV反转录酶)(Toyobo公司),鼠抗人基质金属蛋白酶(MMP)、钙黏蛋白(E-cadherin)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体和羊抗鼠免疫球蛋白-G(IgG)(Cell Signal公司),Eca-109(中科院细胞所),引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 食管癌组织和癌旁组织间质干细胞的分离纯化

新鲜的食管癌组织和癌旁组织块用含青霉素、链霉素及氟康唑的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤浸泡约15 min,洗净残留血液,将组织块剪碎为大约1 mm的组织块并用0.1%Ⅳ胶原酶消化后培养于含20%胎牛血清的L-DMEM中,并种于35 mm培养皿中,37℃,5%CO2,饱和湿度孵箱中培养。待接近融合时用0.25%胰酶室温消化,细胞按1∶3比例传代,若干次传代,即得到纯化的间质干细胞。

1.3 间质干细胞与食管癌细胞株ECA-109非接触共培养

采用六孔板的 Transwell(孔直径为 0.4 μ m,Costar公司)构建共培养体系。分3组:单纯食管癌细胞株Eca-109组、单纯间充质干细胞组、食管癌细胞株 Eca-109位于 Transwell孔的下部,MSCs的膜上。上述细胞培养于含20%胎牛血清的L-DMEM中,72 h后终止培养。

1.4 RT-PCR

按TRIzol试剂盒说明提取上述3组细胞总RNA,使用紫外分光光度计测定RNA浓度。根据RNA纯度将每组的RNA调至每个反应体系中含1 μg。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)引物上游序列为 5′-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3′;下游序列为 5′-GCCACTTGTCGGCGATAAGG-3′;扩增产物为 263 bp。抑癌基因E-cadherin引物上游序列为5′-TGGGCTGGACCGAGAGAGT T;下游序列为3′-ATCTCCAGCCAGTTGGCAG;扩增产物为592 bp。内参GAPDH引物上游序列为5′-CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′;下游序列为 5′-TGTTCTCATACTTCTCAT-3′;扩增产物为 203 bp。对RT-PCR产物进行琼脂糖电泳,数字成像系统进行拍照分析。

1.5 Western blot检测

用预冷的PBS洗涤细胞3遍,收集细胞,用细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,考马斯蓝法定量,95℃煮沸5 min。取40 μg蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳,后将蛋白通过电转膜的方法转移至硝酸纤维膜上,5 g/L脱脂奶粉封闭后,分别与抗MMP-9和E-cadherin单克隆抗体杂交,再与相应的酶标记二抗反应,阳性条带用化学发光法检测,放置Kodak活体成像仪直接数码显色。

2 结 果

2.1 hEC-MSCs形态学特征

胶原酶消化法原代培养14 d后,一般可见少量长梭形贴壁细胞(图1A),培养30 d后,细胞基本可铺满皿底(图1B),传至第3代时能得到比较纯净的间充质干样细胞(图1C)。

图1 少量长梭形贴壁细胞

2.2 RT-PCR

3组细胞均成功地扩增出目的片段,其中间充质干细胞与食管癌细胞株共培养组MMP-9 mRNA表达量明显高于食管癌细胞株,而E-cadherin mRNA表达量明显低于食管癌细胞株(图2)。

2.3 Western-blotting

Western-blotting结果显示间充质干细胞可明显上调食管癌细胞株中的MMP-9表达,显著下调E-cadherin的表达(图3)。

图2 3组细胞RT-PCR

图3 Western-blotting结果

3 讨 论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一。侵袭和转移是影响食管癌患者生活质量及预后的重要因素。E-cadherin是一种重要的细胞黏附分子,是钙黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亚型中的一种,在维持正常上皮细胞形态,细胞极性及组织结构完整性中发挥重要作用,是目前公认的抑癌基因之一[3]。E-cadherin结构和功能异常可导致肿瘤细胞间的黏附能力减弱,使肿瘤细胞易于脱离原发灶而侵入周围组织和血管,进而扩散和转移。研究[4]显示:E-cadherin的低表达与食管癌的转移和侵袭相关,并在食管癌的浸润和转移中起着重要作用。本实验结果显示食管间充质干细胞可下调食管癌细胞株Eca-109中的E-cadherin的表达,表明食管间充质干细胞可参与调节食管癌细胞的侵袭转移。

在肿瘤细胞的侵袭与转移过程中,除与细胞间黏附能力参与其中外,细胞外基质降解亦是其重要步骤之一。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是细胞外基质降解过程中一个重要因子,其属于明胶酶类,作用底物广泛,表达细胞众多。MMP-9可通过降解细胞外基质中的大分子,如胶原和蛋白糖胺等引起组织改型,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。国外研究[5]显示食管癌组织中MMP-9表达水平明显高于正常组织,并在食管癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用。国内研究[6]亦报道MMP-9在食管癌组织中的表达随着肿瘤的浸润深度的增加,阳性表达率增加。本研究结果显示食管间充质干细胞可上调食管癌细胞株Eca-109中的MMP-9的表达,这亦表明食管间充质干细胞可参与调节食管癌细胞的侵袭转移。

目前关于MSCs对肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移等生物学行为的影响还存在着争议。本研究通过将食管间充质干细胞与食管癌细胞共培养,发现间充质干细胞通过影响细胞黏附分子和细胞基质降解酶的表达,参与调节食管癌细胞的侵袭与转移。

[1]Halpern J L,KilbargerA,Lynch CC.Mesenchymal stem cells promote mammary cancer cell migration in vitro via the CXCR2 receptor[J].Cancer Lett,2011,308(1):91.

[2]Bagley R G,Weber W,Rouleau C,et al.Human mesenchymal stem cells from bone marrow express tumor endothelial and stromal markers[J].Int J Oncol,2009,34(3):619.

[3]Ray M E,Mehra R,Sandier H M,et al.E-cadherin protein expression predicts prostate can cer salvage radiotherapy outcomes[J].J Urol,2006,176(4 Pt 1):1409.

[4]Cheng C W,Wu P E,Yu J C,et al.Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast carcinoma:Modification of the twohit hypothesis of tumor suppressor gene[J].Oncogene,2001,20(29):3814.

[5]Tanoka Y,Yoshida T,Yagawa T,et al.Matrix metallo-proteinase-7 and matrix metallo-proteinase-9 are associated with unfavourable prognosis in superficial esophageal cancer[J].Br Cancer,2003,89(11):2116.

[6]王永霞,李道明,李海梅,等.NF-κB p65和MM P-9蛋白在食管鳞癌中的表达及意义[J].广东医学,2011,32(18):2401.

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