联合应用免疫抑制剂治疗大鼠急性脊髓损伤效果观察

冯新民,李小磊,陶玉平,杨建东,王永祥,王静成

(扬州大学临床医学院江苏省苏北人民医院脊柱外科,江苏扬州,225001)

急性脊髓损伤(SCI)是脊柱骨折的严重并发症,其神经功能恢复一直是脊柱外科领域研究的难点。近年来研究发现他克莫司(FK506)和FTY720对神经损伤的修复有较好的效果,为脊髓损伤的治疗开辟了新视野[1-3]。本实验旨在观察大鼠急性脊髓损伤后早期联合使用FK506和FTY720对神经组织是否起保护作用。

1 材料与方法

选取84只Wsitar大鼠,由扬州大学实验动物中心提供,体质量 220～280 g,分成4组:FK506+FTY720联合治疗组(A组,24只)、FK506治疗组(B组,24只),脊髓损伤组(C组,24只)和正常对照组(D组,12只)。采用Allen打击模型建立脊髓损伤模型:麻醉成功后切除大鼠T9、T10椎板,重10 g的铁球从4 cm 高度落下,打击硬膜囊后,大鼠出现摇尾反射,显示脊髓损伤模型建立成功。A组一次性通过尾静脉注射0.3 mg/kg FK506,并予鼻饲0.3 mg/kg FTY720,B组一次性通过尾静脉注射0.5 mg/kg FK506,C组注射生理盐水。对照组仅仅做椎板切除。术后分笼饲养,定时按压膀胱排尿。

分别于术后第6、24和48小时取材,对照组选取3只,其他每组选取6只大鼠。大鼠予以过量戊巴比妥钠麻醉处死后,取出手术段脊髓,在10%的甲醛溶液中固定24 h后,埋蜡,切片,每个组切片5张备用。随机从各组各时间点选取切片3张,行苏木精-伊红染色法(HE染色)后在光镜下观察各组大鼠损伤脊髓组织病理变化。

从各组各时间点剩下的连续切片中随机抽取2张,参考试剂盒说明书进行 TUNEL法染色检测凋亡细胞。切片经过组织固定、脱蜡、水化、洗涤、抗原修复之后,每个样本滴加100 μL TdT酶反应液,避光湿润37℃反应1 h,其次洗涤、加酶标亲和素、DAB法显色、复染,最后中性树胶封片。光镜下观察:凋亡细胞为棕色,正常细胞为蓝紫色统计方法:计算出细胞凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

所有动物在浅麻醉下处于睁眼、清醒、四肢肌力下降等状态,采用肌电诱发电位仪检测SEP潜伏期,刺激和记录电极均采用针电极,将电极置于胫前中份肌肉内,参考电极远侧1 cm处,刺激强度3～6 mA,以引起下肢明显抖动为宜,记录术前术后的SEP的潜伏期变化情况。术后的记录时间点为第1、3和7天。

采用斜板试验和BBB评分法对各组大鼠脊髓损伤后的行为及后肢运动功能进行评定。对照组取3只,其他各组各取6只,分别在术后第1、3、7和14天测定,每项指标共测定3次,以平均值为准。BBB评分者为非本实验组人员且熟知评分标准。评分前所有动物均排空膀胱,防止因膀胱充盈而影响活动。

2 结 果

对照组各个时间点大鼠脊髓组织结构清晰,未见出血坏死、组织水肿或者变性等情况。损伤组SCI后第6小时,可见明显组织损伤,SCI区结构破坏,模糊不清,中央管出血,灰质多灶性出血,白质中偶见小片出血;神经元肿胀、坏死,神经纤维水肿,部分结构模糊不清。SCI后第24小时,可见脊髓组织切片发现损伤区主要位于脊髓灰质,在损伤区中央灰质可见大片出血、细胞肿胀、尼氏体消失,细胞空泡变性、部分细胞核固缩,并有大量单核或多核炎性细胞浸润,有些损伤脊髓组织可出现囊腔样变化。伤后第48小时,灰质被明显破坏,损伤中心见坏死空腔形成,残留周边部分白质。联合治疗组和FK506治疗组大鼠光镜下观察的病理学表现较损伤组轻,并且随着时间的延长,正常的神经元细胞多于损伤组,在各个检测时间点上神经元、灰白质破坏的情况要轻于损伤组。

对照组罕见凋亡阳性细胞,损伤组、联合治疗组和FK506治疗组在伤后第6小时可见凋亡阳性细胞,在伤后第24小时凋亡阳性细胞达到高峰;随后逐渐减少,至本实验观察末期第48小时仍然可见阳性凋亡细胞。联合治疗组和FK506治疗组在各个采集时间的阳性率均低于损失组,差异具有统计学意义(P<0.05),但联合治疗组和FK506组差异没有统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组大鼠术后不同时间点脊髓组织凋亡率的比较(,%)

表1 3组大鼠术后不同时间点脊髓组织凋亡率的比较(,%)

与对照组相比,#P<0.05;与损伤组相比,#P<0.05。

分组 n 第6小时 第24小时 第48小时联合治疗组 6 15.19±2.01＊# 24.22±4.72＊# 13.22±1.32＊#FK506组 6 15.48±1.21＊# 24.40±5.26＊# 13.36±1.25＊#损伤组 6 23.04±3.49＊ 34.18±3.95＊ 18.65±1.16#对照组 3 1.28±0.36 1.01±0.21 0.88±0.04

联合治疗组、FK506治疗组和损伤组的SEP在术后均高于对照组,有显著性差异(P<0.05)。联合治疗组和FK506治疗组术后第1、3、7天潜伏期与损伤组比较均有显著性差异(P<0.05),但是联合治疗组和FK506治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)。联合治疗组和FK506治疗组的潜伏期随着时间的延长而逐渐降低。见表2。

表2 3组大鼠术后潜伏期的比较(,ms)

表2 3组大鼠术后潜伏期的比较(,ms)

与对照组相比,＊P<0.05;与损伤组相比,#P<0.05。

分组 n 术后第1天 术后第3天 术后第7天联合治疗组 6 10.67±0.44＊# 9.24±0.21＊# 8.02±0.18＊#FK506组 6 10.88±0.64＊# 9.40±0.34＊# 8.28±0.27＊#损伤组 6 11.96±0.13＊ 10.81±0.32＊ 10.12±0.23＊对照组 3 3.75±0.11 3.72±0.08 3.69±0.15

损伤组、联合治疗组和FK506治疗组在各个检测时间点BBB评分和斜板实验评分均小于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3、4。损伤组、联合治疗组和FK506治疗组大鼠在术后双后肢肌力完全丧失,并且出现尿潴留和脊髓休克症状。术后第3天开始,联合治疗组和FK506治疗组大鼠的上述两项评分开始高于损伤组,差异有统计学意义(P<0.05),但联合治疗组和FK506治疗组差异无统计学差异(P>0.05)。

表3 3组大鼠术后不同时间点BBB评分结果比较(,分)

表3 3组大鼠术后不同时间点BBB评分结果比较(,分)

与对照组相比,＊P<0.05;与损伤组相比,#P<0.05。

分组 n 术后第1天 术后第3天 术后第7天 术后第14天联合治疗组 6 1.76±0.25＊# 3.59±0.24＊# 8.08±0.92＊# 15.13±0.86＊#FK506组 6 1.73±0.45＊# 3.50±0.84＊# 7.88±1.07＊# 14.91±1.15＊#损伤组 6 1.35±0.25＊ 2.33±0.52＊ 5.16±0.75＊ 9.17±0.35＊对照组 3 19.88±0.55 20.10±0.55 20.37±0.52 20.23±0.41

表4 3组大鼠术后不同时间点斜板实验评分结果比较(,度)

表4 3组大鼠术后不同时间点斜板实验评分结果比较(,度)

与对照组相比,＊P<0.05;与损伤组相比,#P<0.05。

分组 n 术后第1天 术后第3天 术后第7天 术后第14天联合治疗组 6 31.45±2.23＊# 36.58±1.52＊# 43.02±1.94＊# 48.23±2.13＊#FK506组 6 31.00±2.52＊# 36.06±2.52＊# 42.78±2.33＊# 47.83±1.93＊#损伤组 6 30.33±1.86＊ 31.50±2.43＊ 36.50±1.38＊ 40.83±1.60＊对照组 3 63.50±1.28 64.00±0.84 64.00±0.84 64.67±0.80

3 讨 论

急性脊髓损伤多指脊髓遭受外力打击后导致的完全性或不完全性脊髓运动、感觉、括约肌以及反射功能障碍。在脊髓休克期表现为损伤平面以下出现迟缓性瘫痪、运动、反射及括约肌功能丧失和大小便失禁等表现,且预后较差[4-5]。因此,急性脊髓损伤的治疗成为目前研究的热点和难题。

近年来研究[6-7]发现,局部免疫反应引起的继发性损伤在神经损伤机制中起到重要作用。文献报道在同种异体肢体移植时常规使用FK506时,发现移植肢体的周围神经生长速度达到3～4 mm/d,可使得移植肢体提前2个月恢复肢体神经功能[8-9]。潘峰等[3]报道在大鼠急性脊髓损伤后早期应用低剂量FK506可减少神经细胞凋亡,减轻脊髓继发性损伤,并促进脊髓功能恢复。杨梁等[10]报道FTY720能有效促进大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复。

FK506是一种广泛应用于器官移植术后的免疫抑制剂,可通过与其FK受体结合形成复合物而抑制钙调神经磷酸酶介导的T细胞活化,阻碍T辅助细胞释放白介素-2(IL-2)及T杀伤细胞的增殖,从而抑制细胞和体液免疫[11-12]。FK506与其结合蛋白FKBP-12形成FKBP-12复合物通过抑制损伤局部小胶质细胞、巨噬细胞等炎症细胞的聚集、活化及相关炎症因子的释放而减轻继发性炎症反应,从而对损伤局部的神经组织起保护作用[13]。FTY720是从冬虫夏草中提取的一种新型免疫抑制剂,具有免疫效果强、毒副作用小、治疗窗较宽等,还具有与其他免疫抑制剂有良好协同作用的特点。FTY720可显著减少T细胞、B细胞、尤其是CD4+等淋巴细胞的数目,通过调节淋巴细胞对趋化因子的反应性,诱导淋巴细胞归巢至淋巴结,抑制活化的淋巴细胞对炎症组织造成的损伤,从而保护机体组织[14]。

本实验联合治疗组和FK506治疗组大鼠斜板试验评分和BBB评分结果均优于损伤组,但2者之间无显著性差异。光镜下可见损伤组术后48 h灰质和白质大部分坏死,而联合治疗组和FK506治疗组变化明显较轻,缺血坏死区较小,无明显差异,提示FK506和FTY720均具有明确促进脊髓损伤恢复的作用。有研究[15]表明,脊髓损伤后早期细胞凋亡是加重脊髓损伤的重要原因。本实验采用Tunel细胞凋亡检测法观察到损伤早期即可出现大量的凋亡细胞,在24 h达到高峰。损伤组和各药物治疗组在各个取材点的凋亡率有明显的差异性,进一步说明了FK506和FTY720均具有良好的促进脊髓损伤恢复的作用。

虽然目前FK506和FTY720对神经再生的作用机制尚不是十分清楚,但是大量研究结果表明,FK506和FT Y720对神经的保护作用和促进神经损伤功能恢复的作用是明确的,这可能与药物通过多种机制抑制了免疫反应,从而改善了SCI伤后的局部微环境,但具体的机制、药物剂量等尚需进一步实验研究。

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