HRM技术在瘦素基因启动子多态性与肝硬化发生相互关系研究中的应用*

李善高, 曹海军, 刘 军, 徐国萍, 孙明洪, 朱孝鸿, 吕 宾, 孟立娜

(浙江中医药大学附属第一医院 1消化内科， 3 检验科， 4肝病科，浙江 杭州 310006；2中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018)

1000-4718(2012)07-1308-06

2011-12-20

2012-03-08

浙江省自然科学基金资助项目(No.Y2100379)

△通讯作者 Tel:0571-86919331;E-mail:galisga@yahoo.com.cn

HRM技术在瘦素基因启动子多态性与肝硬化发生相互关系研究中的应用*

李善高1△, 曹海军1, 刘 军2, 徐国萍1, 孙明洪3, 朱孝鸿4, 吕 宾1, 孟立娜1

(浙江中医药大学附属第一医院1消化内科，3检验科，4肝病科，浙江 杭州 310006；2中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018)

目的探讨PCR-高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术筛选和分析肝硬化患者瘦素基因启动子C2549和G2548位点突变的可能性，同时研究突变基因型与肝硬化患者生理生化指标之间的关系。方法采用PCR-HRM新型技术，同时对比传统方法PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)，对对照组(n=100)和肝硬化组(n=100)瘦素基因启动子C2549和G2548位点突变进行分析，同时检测生理生化指标。结果(1)PCR-HRMA技术能够有效、高通量、准确地实现对瘦素基因启动子多态性的检测； (2)肝硬化患者瘦素基因启动子主要突变位点在C2549，而G2548位点没有发现突变；(3)肝硬化组中瘦素、游离瘦素指数(FLI)、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)高于对照组，胰岛素敏感指数(ISI)及可溶性瘦素受体(sOB-R)低于对照组，除瘦素外，均有显著差异(P<0.05)；FLI与FINS和HOMA-IR呈正相关(r=0.45、r=0.53,均P<0.05)，与ISI呈负相关(r=-0.34,P<0.05)；(4)肝硬化患者C2549杂合型占优势，肝硬化纯合型和杂合型突变个体中 HOMI-IR、瘦素、sOB-R及FLI均高于野生型，除瘦素及sOB-R外均有显著差异(P< 0.05)。结论PCR-HRM能准确及高通量地实现对瘦素基因启动子多态性进行分析，并验证了A位点基因频率的增高可能和肝硬化发生有关；肝硬化患者存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗，瘦素可能与肝硬化患者胰岛素抵抗发生有关。

高分辨率熔解曲线分析； 瘦素; 基因启动子； 基因多态性； 肝硬化

瘦素(leptin，Lp)是一种由脂肪组织分泌的激素，参与脂肪及能量代谢，进而调节体重。该编码基因由于其启动子区在C2549和C2548位点存在多态性，这些位点突变往往和瘦素调控的相关疾病发生有关[1-2]，但往往由于筛查方法采用PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术，很难进行高通量的相关性统计分析，难以得到较为准确的结论。本研究试图通过PCR-高分辨率熔解曲线分析(high-resolution mel-ting curve analysis)，同时结合生理生化指标的检测分析，以期筛选出与肝硬化发生相关的瘦素基因启动子多态性位点，同时通过该方法得出基因型个体与瘦素相关指标之间的关系。

材 料 和 方 法

1研究对象

收集从2010年3月至2011年9月来我院就诊的乙肝后肝硬化患者100例(肝硬化组)，男性61例，女性39例，年龄37～75岁，平均年龄(54.12±10.13 )岁，均符合2000年9月西安中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订肝硬化诊断标准。血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)均阳性，并排除糖尿病、肾病、心脏病、肿瘤、艾滋病、梅毒及合并严重感染影响激素代谢的疾病。对照组100例，男性69例，女性31例，年龄35～74岁，平均年龄(55.20±8.75)岁，为我院同期健康体检者，均排除各种病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝的健康人群。2组间在性别、年龄和体重指数上相比较无统计学意义，见表1。以上研究对象均为汉族，彼此间无血缘关系。本研究方案由浙江中医药大学附属第一医院医学伦理委员会审批通过，受检者均知情同意。

2方法

2.1生理生化指标测定 隔夜空腹8 h以上抽取肘静脉血，检测空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)。同时取静脉血2 mL，离心后取上清，放置于-80 ℃冰箱里保存，待测血清Lp、可溶性瘦素受体(soluble leptin receptor,sOB-R)。FPG及FINS检测均采用雅培贸易(上海)有限公司提供检测试剂盒检测；其中，FPG采用己糖激酶法检测，FINS采用化学发光微粒子免疫检测法检测；Lp检测采用上海研生生化试剂有限公司提供的人瘦素ELISA检测试剂盒检测；sOB-R检测采用上海优研生化试剂有限公司提供的人可溶性瘦素受体ELISA检测试剂盒检测。测体重及身高，体重指数(body mass index,BMI)=体重(kg)/[身高(m)]2，胰岛素抵抗指数(insulin resistance index was estimated by homeostatic model assessment,HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5，胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)=1/ FPG×FINS，游离瘦素指数(free leptin index,FLI)=Lp/sOB-R。

2.2血液基因组DNA提取 晨抽取空腹静脉血5 mL，EDTA抗凝，采用血液基因组DNA提取试剂盒(杭州浩基生物科技有限公司)进行提取，溶解于10 mmol/L Tris(pH 8.0)中，紫外分光光度计和电泳分析DNA的含量及完整性。

2.3PCR-HRM扩增分析 根据人瘦素基因启动子序列，采用Primer Premier 5.0软件设计PCR-HRM引物，其正反向序列分别是5'-GGCTTTCTAAGCCAAGGCAAAA-3'和5'-GCAACATCTCAGCACTTAGGGAG-3'，扩增长度为222 bp。PCR采用2×SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，反应体系：2×SsoFast EvaGreen Supermix 10 μL，10 μmol/L正向和反向引物 1 μL，50 ng模板基因组DNA，加入去离子水定容到20 μL。反应条件：98 ℃，变性30 s，98 ℃ 5 s、60 ℃ 退火/延伸10 s(收集荧光信号)，循环40次，随后98 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，在70 ℃～90 ℃之间，每隔10 s上升0.2 ℃，进行熔点曲线的制作。该扩增采用CFX96 PCR扩增仪(Bio-Rad)完成，随后采用Precision Melt软件进行校正标准曲线的制作；PCR产物送往上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序鉴定。

2.4PCR-RFLP方法 传统方法采用PCR-RFLP技术扩增基因组DNA片段并进行基因分型，其正向和反向序列分别为：5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3' 和5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，具体扩增条件和体系参照文献[3]。PCR扩增采用2×PCR Master Mix(杭州浩基生物科技有限公司)，简单如下：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L正向引物和10 μmol/L反向引物分别是0.5 μL，50 ng基因组DNA，最后加入去离子水定容到25 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 变性 5 min；94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环35次。242 bp PCR产物经CfoI(HhaI)(Roche)37 ℃消化2 h，产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析及基因分型。当基因型为AA时，2个等位基因均有切点，酶切后有181 bp和61 bp 2条带；CC基因型时，2个等位基因均无切点，酶切后为242 bp 1条带；AC基因型时，一个等位基因有切点，另一个等位基因无切点，酶切后为242 bp、181 bp和61 bp 3条带。

3统计学处理

结 果

1肝硬化组和正常组生理生化指标

肝硬化组总Lp、经BMI调整后Lp、FLI、FINS及HOMI-IR高于对照组，ISI及sOB-R低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。FLI与FINS及HOMI-IR呈正相关(r=0.45,r=0.53,均P<0.05)，与ISI呈负相关(r=-0.34,P<0.05)，说明肝硬化患者存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗；Lp生物学活性与肝硬化患者胰岛素抵抗发生有关。

按性别分类，无论是肝硬化组还是正常组，女性Lp、sOB-R及FLI均高于男性，差异有统计学意义(P<0.01)。但男性肝硬化患者Lp水平同男性对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2血液基因组DNA提取结果

本实验提取的血液基因组DNA，A260/280比值均在1.6～1.8之间，浓度为50～100 mg/L，1%琼脂糖凝胶电泳分析表明提取的DNA是完整的，随机选择基因组DNA电泳结果见图1。

表1对照组和肝硬化组生理生化指标比较

IndexCirrhosisControlSex(male/female)61/3969/31Age(year)54.12±10.1355.20±8.75BMI(kg/m2)22.52±3.2023.07±7.13FPG(mmol/L)5.67±1.645.21±1.07FINS(U/L)14.11±7.92**5.63±3.42HOMA-IR3.55±1.36**1.30±0.52ISI0.01±0.01**0.03±0.02LP(ng/L)16.92±9.03**11.76±8.41 Male10.72±8.68(n=61)8.63±7.21(n=69) Female26.64±7.38**△△(n=39)18.73±9.22△△(n=31)Lp/BMI(ng·L-1·kg-1·m2)0.73±0.42**0.51±0.33sOB-R(ng/L)5.63±2.13**8.18±3.22 Male4.36±2.21**(n=61)6.39±3.72(n=69) Female7.91±3.50**△△(n=39)12.09±4.77△△(n=31)FLI3.01±2.78**1.44±0.98 Male2.46±0.72**(n=61)1.35±0.88(n=69) Female3.37±1.29**△△(n=39)1.55±0.88△△(n=31)

BMI: body mass index; FPG: fasting plasma glucose; FINS: fasting insulin; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index；Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptor; FLI: free leptin index.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmale in the same group.

Figure 1. Electrophoresis analysis of genomic DNA isolated from blood in control and liver cirrhosis patients.M:DNA marker.

图1正常组和肝硬化组随机血液样品基因组DNA电泳结果

3PCR-HRM3种基因型的扩增结果

通过对收集样品瘦素基因启动子序列进行PCR-HRM扩增，然后采用Precision Melt软件(Bio-Rad)进行标准化熔解曲线(normalized melting curve)和差异曲线(difference curve)分析，能够很明显地分为3种类型，然后对这3种类型PCR产物进行测序鉴定，结果发现CC野生型、AA纯合型和CA杂合型3种基因型，见图2。对这3种基因型扩增产物进行了测序分析，发现这一突变发生在2 549位上，而不是发生在2 548位上，这表明2 549位的碱基突变与肝纤维化的发生发展存在相关性。

4PCR-RFLP3种基因型的分析结果

对PCR-HRM扩增结果得到的3种基因型，通过PCR-RFLP方法进行分析鉴定，结果表明PCR-HRM方法鉴定得到的CC野生型，采用PCR-RFLP酶切后出现了242 bp的条带，AA纯合型出现了181 bp和61 bp 2条带，CA杂合型出现了242 bp、181 bp和61 bp 3条带,见图3。

Figure 2. Curves and sequencing results of PCR-HRM products from the three genotypes.A: normalized melting curves of PCR-HRM amplification; B: difference curves of PCR-HRM amplification；C: sequencing results of PCR-HRM products.

图23种基因型PCR-HRM扩增结果

Figure 3. Electrophoresis analysis of PCR-RFLP in the three genotypes.M:DNA marker.

图33种基因型PCR-RFLP产物电泳分析结果

5PCR-RFLP和PCR-HRM2种方法分析样品瘦素基因启动子基因型

通过对100例正常组和100例肝硬化组样品，分别采用PCR-RFLP和PCR-HRM 2种方法对瘦素基因启动子基因进行分型，3种基因型的分析鉴定结果无显著差异(P>0.05)，该结果表明2种基因分析方法对瘦素基因启动子多态性C2549检测具有较好的一致性，说明采用PCR-HRM方法能够准确、高通量实现对肝纤维化中2 549位点突变的检测和分析。分析结果表明：肝硬化组A碱基突变频率明显高于对照组(P< 0.05)，并以C2549杂合型个体占优势(P<0.05)，见表2。

6肝硬化组基因型与生理生化指标的关系

肝硬化组纯合和杂合型突变个体的HOMI-IR、Lp、sOB-R及FLI指标值均高于野生型，除Lp及sOB-R外，其余指标值均有显著差异(P< 0.05)，见表3。这表明C2549A突变可能与肝硬化的发生发展有关。

表2 PCR-RFLP和PCR-HRM瘦素基因启动子C2549位点基因检测结果比较

△P<0.05vsnormal.

表3 肝硬化组不同基因型生理生化指标比较

BMI: body mass index; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index; Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptors; FLI: free leptin index.△P<0.05vswildtype(CC).

讨 论

Lp是作为脂肪细胞分泌的一种激素，能够广泛参与脂肪代谢和能量代谢，该基因位于染色体7q31.3，为单拷贝基因。该基因启动子区存在C2549和G2548两个可能的突变位点，本研究初步发现C2549A突变和肝硬化的发生发展有关，这和国内外的研究相一致[4-5]。

和传统PCR-RFLP技术相比，新颖的PCR-HRM技术是一种新型的突变筛选和分析技术，该技术能够通过扩增产物Tm值0.2 ℃的差别很容易鉴定出野生型和突变个体，利用该技术实现了肿瘤发生相关突变、微生物突变等的快速检测和分析，而且该技术快捷、高通量以及灵敏度较高等优点成为未来基因突变检测分析的重要手段之一[6-7]。本研究中采用PCR-HRM技术，同时对比PCR-RFLP方法，表明该方法能够实现对瘦素基因启动子C2549A突变进行准确、高通量分析，同时简易的操作方法便于基层医疗检测部门进行C2549A分型与肝硬化易感预测分析。

在肝硬化组中，Lp水平高于对照组，但无显著差异；与文献报道一致[8]。而男女个体中，女性Lp水平明显高于男性，这一现象可能与雌激素影响细胞因子的释放有关[9]。sOB-R是主要的Lp结合蛋白，Lp在体内生物学活性与体内总Lp无关，FLI是代表Lp在体内生物学活性的指标[10-11]，本研究中，sOB-R水平在肝硬化组患者中明显减少，FLI明显高于对照组，FLI与FINS及HOMI-IR呈正相关(r=0.45，r=0.53,均P<0.05)，与ISI呈负相关(r=-0.34,P<0.05)，说明肝硬化患者存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗；Lp生物学活性与肝硬化患者胰岛素抵抗发生有关。

肝硬化患者中，C2549A纯合突变型和杂合突变型FLI及HOMI-IR高于野生型，C2549A杂合突变的基因频率明显高于野生型(P< 0.05)，这一结果推测由于C2549突变导致基因启动子双链结构不稳定，尤其C2549杂合突变，利于与Lp相关转录激活因子的结合，导致Lp蛋白的大量表达；该蛋白进而通过和其受体的结合，激活下游JAK/STAT和TGF-β/Smads等信号通路，最终促使肝纤维化、肝硬化的发生发展。因此，收集更多不同省份、不同人种的肝硬化患者血清样品，采用PCR-HRM方法进一步进行C2549A位点突变与肝硬化发生发展的相关性分析，为从瘦素启动子突变来研究肝硬化的发病机制提供更多的理论依据。

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ApplicationofPCR-HRMinthestudyofrelationshipbetweenleptingenepromoterpolymorphismsandlivercirrhosis

LI Shan-gao1, CAO Hai-jun1, LIU Jun2, XU Guo-ping1, SUN Ming-hong3, ZHU Xiao-hong4, LÜ Bin1, MENG Li-na1

(1DepartmentofGastrointestinalMedicine,3DepartmentofLaboratoryMedicine,4DepartmentofHepatopathy,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;2CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China.E-mail:galisga@yahoo.com.cn)

AIM: To analyze the feasibility of PCR-high-resolution melting curve analysis (HRM) for detecting the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter from the patients with liver cirrhosis, and to explore the relevance between mutant genotypes and physiological and biochemical indexes in liver cirrhosis patients.METHODSCompared with the method of PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), the present research used the method of PCR-HRM to analyze the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter in control group (n=100) and liver cirrhosis group (n=100). The physiological and biochemical indexes of the patients were also detected and compared.RESULTSLeptin gene promoter polymorphism was detected using PCR-HRM with effectiveness, high flux and accuracy. Preliminary results showed that the main mutation of the patients with liver cirrhosis was in C2549 site, but not found in G2548 site. Leptin, free leptin index (FLI), fasting insulin (FINS) and insulin resistance index estimated by homeostatic model assessment (HOMA-IR) in liver cirrhosis group were higher than those in control group. Insulin sensitivity index (ISI) and soluble leptin receptor (sOB-R) in liver cirrhosis group were lower than those in control group with significant difference except leptin level. Meanwhile, FLI showed positively correlated with FINS and HOMA-IR (r=0.45,r=0.53,P<0.05), and negatively with ISI (r=-0.34,P<0.05). In the patients with liver cirrhosis, C2549A heterozygous mutation was predominant. The indexes of HOMI-IR, leptin, sOB-R and FLI of C2549A homozygotes and heterozygotes were higher than those of the wildtypes, which showed significant difference except leptin and sOB-R levels (P<0.05).CONCLUSIONPCR-HRM can be more accurate for identifying leptin promoter polymorphism. The increase in the frequency of C2549A mutation may be closely related with liver cirrhosis. Existence of hyperinsulinemia and insulin resistance may be correlated with leptin level in the patients with liver cirrhosis.

High-resolution melting curve analysis; Leptin; Promoter,genetic; Polymorphism,genetic; Liver cirrhosis

R446.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.029