抗病毒分散片质量标准研究

2012-11-06李其凤冯柏康

中国药业 2012年21期

肖飞，陈桦，李其凤，冯柏康

(广州中医药大学科技产业园有限公司，广东广州 510445)

抗病毒分散片由连翘、板蓝根、石膏、知母、石菖蒲、广藿香等中药加辅料组成，具有清热祛湿、凉血解毒之功效，主治风热感冒、温病发热及上呼吸道感染、流行性感冒、腮腺炎等病毒感染性疾病[1]。本试验在抗病毒分散片优选制备工艺基础上，进行产品质量控制方法研究，建立了连翘、板蓝根、知母、石菖蒲薄层色谱鉴别方法，并用高效液相色谱法测定连翘苷的含量。该方法结果准确、操作简便，可作为抗病毒分散片的质量控制方法。

1 仪器与试药

Waters 2695-2996型高效液相色谱系统，包括2695溶剂处理系统、2996二极管阵列检测器、Empower色谱处理系统，(美国Waters公司);BP221S型电子天平(d=0.1 mg)，M215S型电子天平(d=0.01 mg)，均为德国Sartorius公司产品。抗病毒分散片为广州中医药大学科技产业园有限公司自制;连翘苷对照品(批号为11082200406)、菝葜皂苷元对照品(批号为0744-200005)、连翘对照药材(批号为120908-200305)、板蓝根对照药材(批号为121177-200305)、知母对照药材(批号为121070-200306)、石菖蒲对照药材(批号为121098-200402)，均购自中国药品生物制品检定所;阴性样品(自制);乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱(TLC)鉴别

连翘[2-3]:取本品适量，研细，称取4 g，加水30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯充分振摇提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液;另取缺连翘的阴性对照品4 g，同法制成阴性对照品溶液;再取连翘对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(图1 A)。

板蓝根[4-5]:取本品适量，研细，取3 g，加水50 mL，加热回流30min，离心，取上清液置分液漏斗中，用乙醚提取2次，每次30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作为供试品溶液;另取缺板蓝根的阴性对照品3 g，同法制成阴性对照品溶液;再取板蓝根对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(图1 B)。

知母[6]:取本品适量，研细，称取6 g，加水50 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液用水饱和的正丁醇提取2次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇10 mL，盐酸1 mL，加热回流1 h后浓缩至约5 mL，再加水10 mL，用石油醚(60～90℃)30 mL振摇提取，石油醚提取液用0.5%氢氧化钠溶液20 mL洗涤，弃去碱液，再用水20 mL洗涤，弃去水液，石油醚液蒸干，残渣加乙醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液;另取缺知母的阴性对照品6 g，同法制成阴性对照品溶液;再取知母对照药材2 g，同法制成对照药材溶液;取菝葜皂苷元对照品，加无水乙醇制成每1 mL含3 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述4种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-丙酮(19∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以8%香草醛无水乙醇溶液和硫酸溶液(7→10)的混合溶液(0.5∶5)，100℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(图1 C)。

石菖蒲[6-7]:取本品20片，粉碎过40目筛，加水50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液用石油醚(30～60℃)提取2次，每次50 mL，提取液水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液;另取缺石菖蒲的阴性对照品12 g，同法制成阴性对照品溶液;再取石菖蒲对照药材1 g，加石油醚(30～60℃)50 mL，超声60 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液无干扰(图1 D)。

图1 薄层色谱图

2.2 含量测定[8]

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:Merk-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈-水(20∶80);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:277 nm。在上述色谱条件下，连翘苷在24 min出峰，理论板数按连翘苷计算 n=9 523;供试品溶液色谱在对照品溶液色谱相应保留时间上出现一色谱峰，连翘苷峰与其他峰的分离度大于1.5。

2.2.2 溶液制备

称取连翘苷对照品8.04 mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至10 mL，作为对照品贮备液;精密吸取贮备液1 mL，用甲醇稀释至10 mL，作为对照品溶液。取本品10片，研细，取4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，称定质量，浸渍过夜，超声处理25 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，蒸至近干，加中性氧化铝1 g拌匀，加置中性氧化铝柱(200-300目，1 g，内径 1.5 cm)上，用70%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺连翘的阴性对照品4 g，同供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性考察:取连翘苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液，照2.2.1项下色谱条件测定。结果表明其他成分对连翘苷含量测定无干扰。高效液相色谱图见图2。

线性关系考察:精密吸取对照品溶液 2，6，8，10，20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量 X(μg)为横坐标、峰面积值 Y为纵坐标作标准曲线图，连翘苷回归方程为Y=553 564X-6 457.3，r=0.999 9(n=5)。结果表明，连翘苷进样量在0.160 8～1.608 0μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

图2 高效液相色谱图

精密度试验:精密吸取对照品溶液，重复进样5次。结果连翘苷峰面积的 RSD为0.82%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为100321)，精密称取6份，分别照含量测定法制备供试品溶液并测定。结果连翘苷的平均含量为0.037 2%，RSD为2.3%(n=6)，表明方法重复性较好。

稳定性试验:精密量取同一供试品溶液，在室温下，分别在0，2，4，6，8 h时测定连翘苷峰面积。结果的 RSD为 1.4%(n=5)，表明样品中连翘苷在测定的8 h内稳定。

加样回收试验:取同一批样品(批号为100321)，精密称取6份，分别精密加入连翘苷对照品贮备液1 mL，将甲醇挥干，分别照含量测定法制备供试品溶液，测定含量。结果见表1。

表1 连翘苷加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品含量测定

精密称取本品，照含量测定法测定，标准曲线法计算样品中连翘苷含量。结果批号分别为100321，100403，100411的3批样品中连翘苷含量分别为0.28，0.27，0.28 mg/片。根据2010年版《中国药典(一部)》规定，连翘药材以连翘苷(C27H34O11)计，不得少于0.15%;抗病毒分散片以转移率60%计，每粒含连翘苷(C27H34O11)应不低于0.20 mg。故暂订本品每片含连翘以连翘苷(C27H34O11)计，应不低于0.20 mg。