甲基化转移酶Suv39h1基因慢病毒表达载体构建及鉴定

张 帆 卢 韬 孙 荷 吕 娟 杨明峰 董学君

Suv39h1(suppressor of variegation 3～9 homolog 1)是第一个被发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，主要参与H3K9三甲基化(H3K9m3)。近年的研究发现，Suv39h1基因表达与体细胞分化密切相关，随分化成熟其表达量逐渐下降［1～3］。我们在骨髓间充质干细胞(MCS)定向分化肝细胞的研究显示，随肝细胞的分化，Suv39h1表达也呈下调趋势，由此推测其可能是调节肝细胞分化的重要基因，但这方面的研究未见报道;为证明该现象，本研究拟通过增加MCS中Suv39h1的表达，观察对肝细胞分化是否具有逆向作用。在各种表达载体中，慢病毒表达载体具有高效整合、高效转录、高效表达及能转染非分裂期细胞和分裂期细胞的特点，是真核细胞基因转染的理想载体［4～7］。为此，本研究首先构建Suv39h1慢病毒表达载体，验证其功能，旨在为后续MCS分化肝细胞的研究奠定基础。

材料与方法

1．材料:慢病毒载体四质粒系统 pRsv－REV、pMDlgpRRE、pMD2G及 pLenti－eGFP－Neo购自 Tronolab公司。293T包装细胞系、大肠杆菌菌株DH5α均购自中科院上海细胞生物研究所。RPMI1640、DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司。含小鼠全长SUV39h1 cDNA的PCMV－SPORT6载体购自Open Biosystem公司。限制性内切酶Xma1和Kpn1、T4 DNA连接酶及1000bp/100bp DNA ladder购自NEB公司。质粒小量抽提试剂盒购自Axygen公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。PCR、RT－PCR试剂及所需引物盒均购自上海生工生物工程公司。阳性克隆测序为上海比昂生物医药有限公司。

2．方法:(1)引物设计与合成:根据 GenBank的小鼠Suv39h1 mRNA序列及慢病毒表达载体pLenti－GFP－Neo的Kpnl和Xmal双酶切位点要求，设计Suv39h1基因扩增引物，序列如下:上游引物:5'－AAACCCGGGATGGCGGAAAATTTAAAAGG－3'，下游引物 :5'－ GGGGTAGGCTAGAAGAGGTATTTTCGG－3';产物大小:1239bp。引物的合成及PAGE纯化委托上海生工生物工程公司完成。(2)PLenti－eGFPSuv39h1慢病毒表达载体的构建与鉴定:以含有Suv39h1 cDNA的PCMV －SPORTS6质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为:94℃ 3min;94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 1min，36 个循环;68℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收纯化目的片段(方法参照试剂盒说明书)。回收后的目的片段与慢病毒空载体Lenti－GFP－Neo分别进行Xma1和Kpn1双酶切，使其线性化，再次胶回收纯化;配制连接体系线:性化载体(0.1μg/μl)1μl、酶切后的目的基因 5μl、10 × buffer 1μl、ATP 1μl、Ligase 0．7μl和 ddH2O 1．3μl共10μl，16℃过夜连接后转化新鲜配制的大肠杆菌DH5α，涂板培养。挑取单克隆菌落，用质粒小量提取试剂盒抽提其质粒并进行PCR鉴定。PCR阳性克隆质粒，委托上海比昂生物医药有限公司测序，测序结果与GeneBank数据库进行Blast比对和鉴定;同时对阳性克隆质粒进行Kpnl和Xmal双酶切，通过胶电泳鉴定。PCR序列及Kpnl和Xmal双酶切鉴定均与预期符合者，为构建成功的PLenti－eGFP－Suv39h1慢病毒表达载体。(3)慢病毒包装及病毒效价测定:选择生长状态良好的293T细胞，在对数生长期行胰蛋白酶消化，接种于25ml的15cm细胞培养皿培养，待细胞密度达60%～70%时用于转染。将编码慢病毒颗粒的PLenti－eGFP－Suv39h1、pRsv－REV 、pMDlg－pRRE 、pMD2G进行高纯度无内毒素质粒抽提，再制备成慢病毒包装系统 DNA 溶液，质粒用量分别为 20μg、10μg、15μg 和 7．5μg，加入无菌水定容至1800μl，再加入CaCl2(2．5mol/L)溶液200 μl，混匀，加入 2 ×PBS缓冲盐溶液 2000μl，室温放置 20 ～30min后，共同转染293T细胞。转染后12h更换为完全培养液，培养72h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。将收集的上清液于4℃，4000r/min离心10min;通过0．45μm滤器过滤;4℃，25000r/min超速离心20min;最后以500μl冰 PBS重悬病毒沉淀，4℃溶解过夜。经上述浓缩和纯化后即得到高效价的病毒液。用293T细胞逐孔稀释效价测定法来测定效价，稀释浓度从10－2到10－6，同时设置一个空白对照，转染4天后，于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，采集图像，统计分析各组细胞照片，病毒效价为每孔表达 eGFP的细胞数/稀释倍数。(4)RT－PCR分析293T细胞中Suv39h1表达:感染复数(MOI值)为10和30的慢病毒分别转染293T细胞，待细胞长满培养板，收集生长状态良好的目的细胞，采用TRIZOL一步法快速提取总RNA，直接用RT－PCR试剂盒扩增Suv39h1，反应条件为:42℃ 30min;94℃ 15s，58℃ 30s，72℃30s，35个循环;72℃ 10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。

结 果

1．构建慢病毒表达载体PLenti－Suv39h1－eGFP的鉴定:Suv39h1 cDNA克隆载体的Suv39h1 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在1239bp可见一特异条带，片段大小与预期大小一致(图1)。Suv39h1 PCR产物纯化后与载体Lenti－GFP－Neo进行酶切、连接，后转化感受态细胞，划板后挑出7个单克隆菌落PCR鉴定，结果显示其中6个克隆(1～4号和6、7号)可扩增出约1239bp的目的片段(图2)。选取PCR阳性克隆抽提质粒，在Xma1和Kpn1双酶切作用后，得到两条片段，大小分别约为 7500bp和1239bp;同时以未经酶切的质粒作对照，电泳结果显示出明显的3条带(图3)。测序序列经GenBank比对，与NM_011514．2序列一致。电泳和测序结果均证明重组PLenti－Suv39h1－eGFP表达载体构建成功。

2．慢病毒包装及病毒效价测定:慢病毒包装后48h，293T细胞生长状态好，荧光显微镜下显示约95%以上表达绿色荧光，荧光强度高，表明慢病毒包装成功且转染效率高(图4)。等倍稀释后分别感染293T细胞，通过观察eGFP的表达量，测得浓缩后病毒效价为2．11×108TU/ml。

图4 Suv39h1表达慢病毒感染293T细胞后eGFP的表达情况(×100)

3．Suv39h1 mRNAR表达的RT－PCR检测:MOI为10和30的病毒液感染293T细胞后，Suv39h1基因mRNA表达RT－PCR结果显示，MOI为30的细胞其条带明显亮于MOI为10的条带，其亮度大约为后者的3倍，提示得到的病毒液不但能感染293T细胞，并且能在细胞中均匀稳定表达(图5)。

图5 RT－PCR检测转染后293细胞中Suv39h1基因表达

讨 论

Suv39h1是第一个被发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，主要参与H3K9me3，与基因表达抑制有关。目前研究发现，随肌细胞分化成熟，Suv39h1基因表达水平逐渐下降直至不表达，但若早期完全干扰Suv39h1基因表达，肌细胞早、晚期的分化指标将不表达［1］;通过降低Suv39h1及 H3K9m3的表达，神经细胞可以选择性的增加脑源性神经因子和神经因子调节的突触产物，从而促进神经细胞的分化和成熟［2，3］。上述研究提示我们，Suv39h1 及 H3K9m3 在体细胞分化中显著下调，但适当时间 Suv39h1及H3K9m3基因表达，可能是控制体细胞分化启动的重要部分。我们前期研究结果显示，在MCS定向分化肝细胞过程中，Suv39h1逐渐下降，由此我们推测Suv39h1和H3K9me3在启动MCS定向分化肝细胞中可能发挥重要作用，但这方面的研尚未见报道。将Suv39h1导入肝细胞诱导的MCS中是探讨其在肝细胞分化中作用最直接、最有效的方法。

慢病毒载体是在HIV－1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，是目前感染效率最高的载体，与其他原核、真核载体和反转录载体相比，其优点在于:既能感染分裂期细胞，又能感染非分裂期的细胞，能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系，其介导的基因表达作用持续且稳定，目的基因能整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂，且免疫反应小，因此是基因转染的理想载体［4～6］。本实验采用目前较先进的四质粒系统，由pRsv－REV、pMDlgpRRE、pMD2G和pLenti－eGFP－Neo组成，其中 pRsv－REV、pMDlg－pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，pLenti－eGFP－Neo编码的绿色荧光蛋白和Neo抗性基因有利于转染后细胞的观察及筛选，更重要的是剔除了致病基因，使慢病毒具有较高的安全性。

本研究以明确含有小鼠Suv39h1基因的cDNA克隆载体为模板，经PCR扩增获得Suv39h1基因，进一步构建该基因的慢病毒表达载体。将PCR阳性菌落的质粒抽提，在Xma1和Kpn1双酶作用下，得到两条片段，大小分别约为7500bp和1300bp，其中小片段分子质量大小与Suv39h1分子质量大小一致;阳性菌株DNA测序序列的BLAST比对结果也证实，其序列与 Suv39h1序列相符;电泳和测序结果均表明Suv39h1基因已成功导入pLenti－eGFP－Neo慢病毒表达载体。包装后的病毒颗粒等倍稀释后分别感染293T细胞，直接通过荧光显微镜观察eGFP的表达量，测得其效价为2.11×108TU/ml，病毒颗粒的效价高;同时发现，293T细胞转染后72h约95%以上均表达绿色荧光蛋白，证明所构建慢病毒载体可以高效转染入293T细胞，并稳定表达。本实验成功构建和验证了Suv39h1基因慢病毒表达载体，有助于通过导入Suv39h1基因，为研究Suv39h1在MCS定向分化肝细胞中的作用以及调控机制奠定基础。

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