柯萨奇B4病毒5′UTR基因序列及遗传进化分析

周 密，李 凡，王艳艳

（1.长春医学高等专科学校，吉林 长 春130031；2.吉林大学白求恩医学院；3.吉林大学第一医院 儿 科）

柯萨奇B4病毒（Coxsackievirus B4，CVB4）属于肠道病毒属，可引无菌性脑膜炎、病毒性胰腺炎、出疹性发热等多种临床疾病。近年研究表明其感染与Ⅰ型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1D）的发生密切相关［1，2］。CVB4病毒基因组由约7 395个碱基构成，基因组依次分为5′端非编码区（Untranslated Region，UTR）、P1、P2、P3 区和3′端非编码区。虽然5′UTR并不编码蛋白质，但它在病毒复制增殖和形成感染中发挥重要作用。研究表明，脊髓灰质炎病毒神经毒性［3］和CVB3心肌毒力的位点［4］均位于5′UTR。CVB4与其他肠道病毒一样，具有广泛的疾病谱，说明不同CVB4变异株具有不同的毒力表现。国外研究主要采用标准株和基因工程株，本研究采用在小鼠中表现为胰腺毒力（引起小鼠糖尿病样综合征）的CVB4毒株［5］，将其5′UTR基因克隆测序，并对其基因序列的同源性、遗传进化趋势及变异性进行研究，研究结果将加深对该病毒毒力相关基因的认识，同时为采用分子生物学技术对相关疾病进行实验室诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及试剂 CVB4jlu06株和Hep－2细胞株，由吉林大学保存。细胞营养液（IMDM）为美国Sigma公司产品；Trizol试剂、逆转录酶为Invirogen产品。限制性内切酶、Tag DNA聚合酶、RNA提取试剂盒及p MD19－T载体均为Ta KaRa公司产品。

1.2 病毒5′UTR基因的克隆测序 参照GenBank中标准株CVB4JVB序列（X05690）设计5′UTR基因引物，上、下游引物序列分别为：5′－TTAAAACAGCCTGTGGGTTGTACC－3′和 5′－TTTATCGTATTGAGTCTCAATATG－3′。Trizol法提取病毒RNA，以病毒基因组RNA为模板进行RT－PCR反应。PCR反应条件为94℃预变性2 min，94℃45 sec，52℃45 sec，72℃2 min，进行35个循环。PCR产物经电泳分离纯化，与p MD19－T载体连接，鉴定后送上海生物工程技术服务公司测序。

1.3 病毒5′UTR基因序列分析 DNA序列及同源性分析利用DNAStar和MEGA4生物分析软件进行，相关参比序列选自GenBank，包括CVB4 Tuscany（DQ480420）、CVB4 J.V.B.（X05690）、CVB4 E2b（AF311939）和CVB4 E2（S76772）。

2 结果

2.1 病毒5′UTR基因序列特点 CVB 4jlu06株5′UTR基因由743个碱基组成，5′UTR之后为编码区和3′非编码区，这种结构与柯萨奇B4病毒的标准株CVB4JVB相一致。分析发现，与其他CVB病毒一样，RNA二级结构可分为11个茎－环（stemloop）结构（即茎－环A－K），其中含有富含嘧啶的S－D样（Shine－Dalgarnolike）序列区域（序列为 UUCCUUUU），该区域在病毒复制过程中通过碱基配对方式完成核糖体进入过程。

2.2 病毒5′UTR核苷酸序列同源性分析 将CVB 4jlu06株5′UTR核苷酸序列与CVB4已发表序列进行同源性分析，其中CVB4jlu06株与CVB4JVB和CVB4Tuscany株显示了高度的同源性，分别为99.6%和99.5%，而与CVB4E2、CVB4E2b显示了较大差异性，分别为13.3%和13.5%（如图1所示）。

图1 CVB45′UTR核苷酸序列同源性分析

2.3 病毒5′UTR基因遗传进化分析 在同源性分析的基础上，构建了CVB4的5′UTR核苷酸序列遗传进化树（如图2所示）。CVB4jlu06、CVB4JVB和CVB4Tuscany共同聚簇，显示了高度同源性，说明三者具有相同的进化途径；而CVB4E2、CVB4E2b处于另一个分支内，共同聚簇，与前三者有不同的进化途径。

图2 CVB45′UTR核苷酸序列遗传进化分析

2.4 病毒5′UTR核苷酸变异分析 采用Megalign分析工具对病毒5′UTR核苷酸序列进行多重比对分析，发现在三个位点jlu06株与E2株、E2b及Tuscany株（致糖尿病株）有共同的核苷酸，而与JVB株（非致糖尿病株）不同。核苷酸及其变异位点分别为C546G（先给出的是jlu06株的核苷酸）、G137A和A136T，这些位点分别位于RNA茎－环G（SLG）和RNA茎－环C（SLC）。

3 讨论

近年来，对肠道病毒基因变异研究表明，病毒RNA一些位点突变可能引起小核糖核酸病毒的重要生物学特性改变［6］。在对脊髓灰质炎减毒活疫苗PV3神经毒性研究中发现，病毒5′UTR的一个核苷酸的改变就可以使病毒毒力丧失或回复［3］。在对CVB3心肌毒力的研究中发现5′UTR是决定心肌毒力表型的主要区域（nt88－181）［4］，这些结果说明小RNA病毒5′UTR核苷酸的变异对决定病毒的毒力表型起着重要作用。5′UTR虽然不编码蛋白质，但由于小RNA病毒在复制增殖过程中以非帽依赖方式进行，其5′UTR中存在着核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES，包括茎－环结构SLF到SLI），该构型中富含嘧啶的S－D样区域，通过碱基互补配对方式，完成与核糖体的结合，从而开始病毒的复制。因此，5′UTR结构与病毒的复制增殖、宿主范围和毒力等生物学特征密切相关［7］。本研究采用来自中国本土、在动物实验中引起小鼠糖尿病样综合征的CVB4jlu06株，为研究其毒力表现的分子基础，对该株病毒5′UTR基因序列进行了变异性和遗传进化分析，结果表明该株病毒与标准株JVB和Tuscany株具有相同的进化途径，同源性较高，且在该区域内三个位点的核苷酸发生了有意义的变异，分别是C546G、G137A和A136T，这些位点与致糖尿株（E2、E2b及Tuscany）相同，而与非致糖尿病株（JVB）不同。C546G位点位于RNA茎－环G，在核糖体进入位点构型中，其他两个位点位于茎－环C，上述三个位点核苷酸的变异可能会影响到病毒复制增殖能力，使其具有与标准株不同的致病表型。但上述变异是否决定了该株病毒引起小鼠糖尿病样综合征，尚需进一步研究确定。未来可以选择较多有相同毒力表型的毒株，进行基因变异分析，并运用分子生物学技术，进行基因定位研究，最终确定具有潜在致糖尿病性柯萨奇病毒的毒力相关基因，为临床相关疾病的实验室诊断技术及防治研究奠定基础。

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［5］周 密，李 凡.柯萨奇病毒B4对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响［J］.中国生物制品学杂志，2008，21（3）：204.

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