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人原发性肺癌组织中TSLC1基因甲基化检测及意义

2012-11-05亢春彦汤少鹏薛玉仙张秀芝吕丰收

中国实验诊断学 2012年8期
关键词:吸烟者鳞状细胞株

亢春彦,陈 洁,肖 红,汤少鹏,薛玉仙,张秀芝,吕丰收

(1.河南职工医学院病理学教研室,河南 郑 州451191;2.河南省胸科医院胸外科,河南 郑 州450003)

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer 1)基因,是正常人体组织广泛表达的免疫球蛋白样细胞黏附分子[1]。已证实TSLC1启动子区甲基化在多种肿瘤中是一个频发事件,与TSLC1的表达下调呈相关性[2-4]。

本研究采用甲基化特异性的聚合酶链技术(Methylation specific PCR,MSP),检测了人原发性肺癌组织、肺良性病变组织、癌旁组织及支气管鳞状化生组织中TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状况,观察TSLC1基因在不同肺组织中的甲基化状态,探讨其与肺癌发生发展之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集 收集53例肺癌手术切除标本,24例肺良性病变组织,15例癌旁组织和11例支气管鳞状化生镜检组织。标本取自河南省胸科医院。入组条件:(1)患者均经过病理确诊(2)患者未经任何放、化疗(3)无其他肿瘤病史。肺癌组:鳞癌31例、腺癌16例、小细胞癌6例。肺良性病变组:肺结核9例,肺炎8例,炎性假瘤4例,肺脓肿2例,间质性肺病1例。标本于术后或镜检后半小时内获得,-70℃冰箱保存。

1.2 DNA的提取 采用DNA纯化试剂盒(上海生物工程有限公司)提取组织基因组DNA,操作步骤按说明书进行。

1.3 DNA的修饰 采用DNA修饰试剂盒(Chemicon公司)亚硫酸氢盐修饰基因组DNA,修饰后的DNA通过乙醇沉淀回收并重悬于去离子水中,用于甲基化特异性PCR。

1.4 寡核苷酸引物 设计合成2种引物:甲基化特异的引物(TSLC1-M),上游引物5’'-TTTTAATTATTTTCGAGTTTATCG;下游引物5’-TCTT-TAAAAACGAAAACTATACG。非甲基化特异的引物 (TSLC1-U),上 游 引 物 5’-TTTTTAATTATTTTTGAGTTTATTG;下 游 引 物 5’-AATCTTTAAAAACAAAAACTATAC。2种引物扩增片断长度均为109 bp。

1.5 PCR扩增反应及检测方法 PCR反应体系总体积为50μl:10×PCR缓冲液2.5μl,10 mmol/L 4×d NTP 4μl,25 mmol MgCl24μl,上下游引物各1μl,已修饰的DNA模板10μl,Taq酶2U。反应条件为:94℃预变性5 min;94℃1 min,特定退火温度(TSLC1-M:60℃;TSLC1-U:57℃)1 min,72℃1 min,共35个循环;72℃延伸10 min。为保证检测的可靠性,以经甲基化转移酶(SssI Methylase)处理的和未经SssI酶处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作阳性和阴性对照。不含DNA的蒸馏水作为空白对照。PCR产物2%琼脂糖电泳分离,紫外检测仪下观察并拍照。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件,对各组间的比较采用χ2检验,用精确概率法确定概率。

2 结果

2.1 TSLC1基因目的片断的MSP扩增结果(图1,图2)

图1 T-M引物PCR扩增结果

M 为 Marker(DL2,000);1,2为肺癌标本;3,4为癌旁组织;5,6为肺良性病变组织;7为支气管鳞状化生组织;8,9分别是阳性和阴性对照;10为空白对照

2.2 MSP结果分析

2.2.1 TSLC1基因甲基化在各组中发生率的比较提取肺癌组,癌旁组和良性病变组中的基因组DNA,进行甲基化检测,甲基化率分别为35.8%(19/53)、13.3%(2/15)、0%(0/24),三组比较差异有统计学意义(P<0.05),进一步做两两比较,肺癌组与良性病变组有显著性差异(P<0.01);癌旁组与良性病变组差异也具有统计学意义(P<0.05)。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18.2%,高于良性病变组(0%),但两者相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。

2.2.2 TSLC1基因甲基化与肺癌病理类型的相关性 对全部53例肺癌组织DNA进行MSP扩增,结果显示31例鳞癌、16例腺癌和6例小细胞癌中TSLC1基因甲基化阳性率分别为38.7%(12/31)、37.5%(6/16)、16.7%(1/6),经统计学检验,三者间差异无统计学意义(P>0.05),即TSLC1基因甲基化发生率与病理类型无相关性(表1)。

2.2.3 TSLC1基因与肺癌临床病理特征的相关性(表1)

表1 TSLC1甲基化状态与肺癌临床病理资料的关系

2.2.4 肺癌吸烟者与非吸烟者TSLC1基因甲基化比较 53例肺癌患者按吸烟指数(每天吸烟支数×吸烟年数)的不同分为吸烟组(≥400支)和非吸烟组(≥400支),分别进行TSLC1基因甲基化的检测,40例吸烟者中16例发生TSLC1基因甲基化,阳性率为40.0%,13例非吸烟者TSLC1基因甲基化阳性率为23.1%(3/13),差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

基因启动子区甲基化改变不仅直接或间接影响基因转录,也可通过5-甲基胞嘧啶脱氨基诱发胞嘧啶转变为胸腺嘧啶,诱发基因表达异常,还可引起染色体结构改变,导致基因表达不稳定从而产生肿瘤[5]。Heller等[6]研究了 TSLC1在肺癌细胞株中的表达和甲基化形式。结果显示:44%的NSCLC细胞株及9%的小细胞肺癌细胞株中发现TSLC1表达缺失;33%的NSCLC细胞株、9%的SCLC细胞株中存在TSLC1甲基化。但是,关于TSLC1基因甲基化与人原发性肺癌组织的关系的研究却还不够深入。

MSP法特异性高,敏感性高,有少许肿瘤细胞发生甲基化即可被检测出。本研究结果表明肺癌组织中TSLC1基因启动子高甲基化发生率为35.8%,15例癌旁组织有2例出现了甲基化阳性片断,肺良性病变组织没有1例发生甲基化。提示TSLC1基因启动子甲基化与肺癌的发生关系密切,对肿瘤的生长、局部浸润可能起一定的促进作用。支气管鳞状化生组织甲基化检出率为18.2%(2/11),进一步提示,TSLC1基因甲基化在肺癌的发展过程中可能是一个早期事件,是多步骤肺癌发生过程的始动因素。TSLC1基因甲基化在肺癌不同组织分型、病理分级、临床分期,是否淋巴结转移间均无显著性差异,说明TSLC1基因甲基化可能与肺癌组织分型、病理分级、临床分期及肿瘤的转移和预后无关。

研究证实,吸烟是肺癌发生的危险因素,香烟中含有BPDE等致癌物。BPDE-DNA加合物在甲基化的Cp G与非甲基化Cp G位点的分布区别很大,Cp G中5-MC是容易形成加合物的位点,因而与DNA中其它碱基相比,甲基化的Cp G可能更容易受到BPDE等化学致癌物的攻击[7]。本实验对肺癌吸烟者(40例)和非吸烟者(13例)分别进行TSLC1基因甲基化的检测,结果显示,吸烟的肺癌患者TSLC1基因甲基化率为40.0%(16/40),明显高于非吸烟肺癌患者(23.1%,3/13),但两组间差异无统计学意义。该结果提示,吸烟可能不是TSLC1的启动子发生甲基化的主要机制,结合本实验考虑也可能与实验标本过少,难以全面确切证明TSLC1基因甲基化与吸烟的关系,但不可否认的是有一部分吸烟患者确实发生了TSLC1启动子区的甲基化,因此甲基化与吸烟的关系需作进一步的探讨。

综上所述,TSLC1基因甲基化与肺癌的发生关系密切,可能是肺癌早期的重要标志物之一。因此对TSLC1基因甲基化进一步研究可能对探讨肺癌的发生发展机制,以及肺癌的早期预警有重要意义。

[1]Heller G,Geradts J,Zieqler B,et al.Downregulation of TSLC1 and DAL-1 expression occurs frequently in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2007,103(3):283.

[2]Tsujiuchi T,Sugata E,Masaoka T,et al.Expression and DNA methylation patterns of Tslc1 and Dal-1 genes in hepatocellular carcinomas induced by N-nitrosodiethylamine in rats[J].Cancer Sci,2007,98(7):943.

[3]Chen K,Wang G,Peng L,et al.CADM1/TSLC1 inactivation by promoter hypermethylation is a frequent event in colorectal carcinogenesis and correlates with late stages of the disease[J].Int J cancer,2011,128(2):266.

[4]Overmeer RM,Henken FE,Snijders PJ,et al.Association between dense CADM1 promoter methylation and reduced protein expression in high-grade CIN and cervical SCC[J].J Pathol,2008,215(4):388.

[5]Toyooka S,Mitsudomi T,Soh J,et al.Molecular oncology of lung cancer[J].Gen Thorac Cardiovasc Surg,2011,59(8):527.

[6]Heller G,Fong K M,Girard L,et al.Expression and methylation pattern of TSLC1 cascade genes in lung Carcinomas[J].Oncogene,2006,25(6):959.

[7]Breitling LP,Yang R,Korn B,et al.Tobacco-smoking-related differential DNA methylation:27K discovery and replication[J].Am J Hum Genet,2011,88(4):450.

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