壳聚糖对阿萨希毛孢子菌生物被膜形成的影响

樊 昕，任晓萍，李海涛，杨蓉娅

（北京军区总医院 全军皮肤病诊治中心，北京100125）

壳聚糖（Chitosan）是由葡糖胺和N－乙酰基葡糖胺构成的生物共聚物，经天然生物大分子甲壳素脱乙酰基转化而来，其结构类似糖胺聚糖（glyeosaminoglycans，GAGs），具有良好的生物相容性、生物可降解性以及抗菌消炎、止血促愈等生理功能，是优异的医用敷料及组织工程材料［1］。但是壳聚糖是否会影响真菌生物被膜（fungus biofilm）的形成尚未见相关报道。本实验应用不同浓度壳聚糖观察其对阿萨希毛孢子菌生物被膜（T.asahii BF）形成的影响，为临床研究调控真菌生物被膜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：阿萨希毛孢子菌株1株，来源于本院皮肤科临床分离株（BZP07002），并经API20AUX生化鉴定及 DNA 序列分析验证（AS2.2174）［2］

主要试剂及材料：RPMI 1640培养基和壳聚糖购自美国Sigma公司，XTT试剂购自美国Appli－Chem公司，PMS购自Sigma公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，全自动酶联免疫测定仪购自美国Bio－rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜体外构建 将－80℃保存的阿萨希毛孢子菌菌种复苏，在沙氏培养基中转种培养2次，转入酵母蛋白胨葡萄糖肉汤（YPD）中过夜振荡培养，离心、收集后，重悬于RPMI－1640中，稀释成106CFU∕ml菌悬液。在培养板中预先放入无菌的聚苯乙烯（长宽各为1.0 cm）。将2 ml该菌悬液加入到24孔培养板中，选择30℃培养48－72 h。2 h时PBS缓冲液冲洗2次，重新加入2.0 ml RPMI－1640培养液。之后每隔24 h更换一次培养液。设不加有阿萨希毛孢子菌的空白对照组。

1.2.2 生物被膜形成的定量分析 通过XTT还原比色测定法进行定量分析。测定依据通过代谢活性细胞使黄色的四唑盐XTT分裂成橘黄色的甲臜染料。RPMI 1640培养液中加入XTT和电子耦合剂PMS使终浓度为12.5μmol／L。在预先洗涤培养的生物膜孔和空白对照孔中放入1.5 ml的XTTPMS溶液，30℃避光培养2 h。离心上清液平分在96孔板中，微量滴定板492 nm下读数。同时将含有生物被膜的聚苯乙烯材料放入YPD液体培养基中，32℃培养48 h，通过细胞计数板计数评估总的活菌数。

1.2.3 倒置显微镜观察 将已构建生物被膜的聚苯乙烯用灭菌的PBS缓冲液冲洗2次，放置在载玻片上倒置显微镜下观察。

1.2.4 壳聚糖的配制 称取一定量的壳聚糖，用1%冰醋酸溶解后，无菌水稀释配制0.25 mg／m L，0.50 mg／m L，0.75 mg／m L，1.0 mg／m L，1.25 mg／m L和1.5 mg／m L壳聚糖溶液，将生物材料放入配制壳聚糖溶液5 ml中32℃孵育，分别在生物膜模型放入前（0 h）和模型放入后第48 h和96 h进行倒置显微镜观察和XTT定量分析。

1.2.5 不同浓度壳聚糖对生物被膜作用的吸光度检测：取菌悬液50μl加入含有不同浓度壳聚糖150 μl／孔的96孔板培养；实验过程中每组做3个平行孔，重复3次实验，以不含菌悬液的孔作为基线对照；48－72 h取出相应的96孔板。吸出孔内菌悬液，PBS清洗孔3次去除浮游细菌，微孔板在室温下干燥30 min；加入1%Crystal Violet200μl／孔染色，放置20 min后吸出染液，PBS清洗孔3次去除孔壁染液，微孔板在室温下干燥30 min；加入95%乙醇200μl／孔微量振荡器上震荡30 min复吸染液，复吸液放入一新的96孔微孔板中；全自动酶联免疫仪测定630 nm处的吸光（OD）值，并绘制曲线。

1.3 统计学方法

用SPSS13.0统计软件分析。采用单因素方差分析（F）和LSD－t检验进行多个样本均数的两两比较。取α＝0.01为检验水准，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

用全自动酶联免疫测定仪630 nm可见光测定阿萨希毛孢子菌生物膜OD值时发现，48 h内0.25 mg／m L，0.5 mg／m L，0.75 mg／m L和1.0 mg／m L壳聚糖溶液没有明显抑制生物膜形成的作用；1.25 mg／m L壳聚糖溶液明显具有抑制T.asahiiBF形成的作用，菌体均处于浮游状态，小部分形成团块，60 h后逐渐形成生物膜结构但是结构松散，96 h后逐渐消失抑制作用，但XTT值和活菌数均小于正常T.asahiiBF形成的数值。（见表1，图1，2）

表1 1.25 mg／mL壳聚糖对T.asahii BF的定量 XTT测定（x－±S）和活菌计数

图1 1.25 mg／m L壳聚糖对T.asahii BF的定量XTT测定和活菌计数

图2 不同浓度壳聚糖对T.asahii BF形成情况

3 讨论

近年来临床各种医用材料的使用率很高，特别是侵入性治疗例如体外插管等操作使耐药真菌数量及种类迅速增加和出现交叉耐药［3］，同时各种微生物易于粘附于其表面且可形成生物被膜，导致耐药性增加而感染灶不易清除［4］。既往我们的研究表明［5，6］：阿萨希毛孢子菌可以形成生物被膜，当生长趋于成熟时，代谢的活性相对稳定，但仍保持在一个高水平；生物被膜中存在孔隙结构，活菌围绕在孔隙周围并被死菌包裹，使活菌一方面可直接从孔隙中获得营养，又可抵御环境中有害物质的破坏。进一步研究我们发现［7］：不同培养条件下例如培养温度、p H等会明显影响生物被膜的生长。

本研究发现：48 h内 0.25 mg／m L，0.5 mg／m L，0.75 mg／m L和1.0 mg／m L壳聚糖溶液没有明显抑制生物膜形成的作用，但是生物膜形成总体类似p H偏酸性的表现；1.25 mg／m L壳聚糖溶液明显具有抑制T.asahii BF形成的作用，菌体均处于浮游状态，小部分形成团块，60 h后逐渐形成生物膜结构但是结构松散，96 h后逐渐消失抑制作用，但XTT值和活菌数均小于正常T.asahii BF形成的数值。由于壳聚糖是一种高分子生物材料，现已证实壳聚糖对多种细菌的生长具有抑制作用，表现出类似抗生素的特征。壳聚糖的抗菌作用主要有以下2种机制：大分子壳聚糖通过自身所带的正电荷与微生物细胞膜所携带的负电荷相互作用，破坏细菌细胞壁原有结构，造成细胞成分的泄漏而起到抗菌作用；小分子壳聚糖，通过渗透进入细胞内，与带有阴离子的生物大分子发生类似“絮凝”作用，扰乱细胞的正常生理功能，从而抑制细菌的繁殖和生长［8］。我们分析壳聚糖具有抑制生物被膜的作用主要是由于本身的电荷与真菌之间的差异性导致真菌代谢异常而呈现低水平增殖活性，其黏附与材料表面的附着力也相应减低或者暂时受到抑制，但是由于壳聚糖抑制真菌作用是有一定时效性，因此时间较长96 h后逐渐失去其抑制生物被膜的作用，但是其具体调控机制尚待进一步深入探讨和研究，这也是我们日后关注的焦点和研究方向。

本实验发现48 h时具有清除作用，而96 h已经不能清除真菌，说明壳聚糖清除阿萨希毛孢子菌减少的机制，可能有多种原因：其一是壳聚糖作为多聚阳离子两性电解质，可以附着于生物膜的底物及真菌表面，改变了两者的电荷性质，减少了两者的相互作用和改变了真菌表面的疏水性，从而导致生物膜的脱离；其二是由于壳聚糖灭活真菌后的自然减少［9］。在酸性条件下，壳聚糖分子吸附到真菌细胞壁上，使细胞壁和细胞膜上负电荷分布不均，干扰细胞壁合成，导致细菌裂解而死亡；另一方面壳聚糖进入细胞内，与真菌DNA形成稳定的复合物，阻碍DNA或RNA的合成，从而抑制真菌的繁殖［10］。我们还认为壳聚糖可能会通过在菌体表面形成保护膜，阻止营养物质的进入来达到抑菌目的。此外我们假设认为壳聚糖可能会直接引起真菌菌丝生长的抑制作用，在调节菌丝生长中某些重要的抑制与菌丝生长有关的基因，这也是我们今后研究的方向和主要内容。

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［5］任晓萍，杨蓉娅，樊 昕，等.几种不同基质对阿萨希毛孢子菌形成生物膜影响的初步观察［J］.中国真菌学杂志，2010，5（4）：201.

［6］任晓萍，樊 昕，杨蓉娅，等.阿萨希毛孢子菌生物膜形成研究［J］.中华皮肤科杂志，2010，43（8）：16.

［7］樊 昕，任晓萍，李海涛，等.不同培养条件下对阿萨希毛孢子菌生物被膜影响的研究［J］.中国实验诊断学杂志，2011，15（5）：761.

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