椎间盘内注射转化生长因子-β1 诱导椎间盘退变

高春华，吕 明，杨 诚，庞晓东，李端明，杨 洪，彭宝淦

椎间盘退变是引起慢性腰痛的主要原因之一，也是一个非常复杂的生物学过程。Peng 等［1-3］一系列研究发现，疼痛椎间盘在细胞的组成和结构上均与无疼痛症状的退变椎间盘不同。疼痛的椎间盘首先是一个退变的椎间盘，病理特征性是椎间盘内形成富含神经纤维的炎性血管化肉芽组织，一些生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growing factor，bFGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)大量表达;老化椎间盘虽然是一个退变的椎间盘，但盘内无血管肉芽组织形成，仅有少量生长因子的表达。TGF-β1是一种稳定的多功能的多肽生长因子，能提高体外培养的髓核细胞的蛋白多糖合成作用［4］，它们不仅可以控制机体的发育、生长，还可控制组织的再生和创伤愈合，也能促进组织的不正常改变。在疼痛椎间盘，bFGF、TGF-β1 和CTGF 既在肉芽组织内大量表达，也在非肉芽组织部位表达。近期有研究表明，退变椎间盘内注射生长因子可以通过改善髓核细胞内环境进而延缓椎间盘退变，但从目前的研究结果可以看出，生长因子广泛存在于退变的椎间盘内，该物质对椎间盘退变的各个时期是否都起到一定的修复作用亦或可以促进椎间盘的退变尚不得而知。

1 材料与方法

1.1 实验材料

10 只6月龄的雄性山羊，平均体重为30 kg。

1.2 观察指标

1.2.1 腰椎侧位X 线片椎间盘高度变化

拍摄腰椎正侧位X 线片，测量L4/L5/L6/L7椎间隙高度。采用岛津500 型数字X 线机于术后2、4、6个月时分别观察测量椎间盘高度指数(disk height index，DHI)。测量时山羊行全身麻醉后自然放置检查台上，以L5椎体为投照中心拍摄山羊腰椎侧位X线片。测量精度0.1 mm。测量及计算方法见图1。

图1 DHIFig.1 DHI

1.2.2 椎间盘退行性病变程度

采用德国Siemens 公司1.5T 超导型MRI 扫描仪，置于腰椎扫描表面线圈内，自旋回波脉冲系列成像。扫描参数:T2 加权TR/TE 为4 500/130 ms，矢状位扫描层厚2 mm，层间隔0 mm;在中矢状位T2加权像上运用MRI 扫描仪自带软件MR2002M 对椎间盘髓核高信号区进行描记，自动测量高信号区面积。

1.2.3 组织学评价

观察椎间盘标本的组织学变化，参考Masuda 评分［5］标准，比较3组椎间盘的组织学评分。

1.3 动物处理

实验动物肌注速眠新(0.3 mL/kg)和氯胺酮(40 mg/kg)进行全身麻醉，剪去背中部和左肋胁部毛发，取右侧卧位，手术区分别用碘酒和酒精消毒，从肋床下缘约4 cm 偏离椎旁肌2 cm 纵形切开皮肤直到骨盆环。小心分离皮下组织、腹膜外脂肪和椎旁肌暴露L3～7椎体前外侧(山羊有7 个腰椎)。术中定位:山羊髂嵴水平正对L7，触摸到的腰椎间盘前方最凸点为椎间盘前正中点。仔细暴露出L4/L5/L6/L7椎间盘前方纤维环穿刺点，用皮试针头经椎间盘前正中平行于临近上下终板小心刺入髓核(刺入髓核时有明显的落空感)。L4/L5椎间盘注入0.2 mL 生理盐水作为对照椎间盘，L5/L6椎间盘注入0.2 mL TGF，L6/L7椎间盘注入0.2 mL FGF。完成操作后，用不吸收线逐层缝合深、浅筋膜和皮肤。在整个操作过程中注意不破坏椎体的骨膜组织和上下终板。分别于术前、手术结束时和术后3 d 肌注青霉素2.5×105U/kg。

1.4 标本收集与处理

术后2、4、6 个月时分别观察测量一下指标所有动物每3周检测1 次，记录X 线片上椎间盘的高度指数和MRI T2 加权像上的椎间盘高信号区的面积、椎间盘的形态学变化。术后6 个月通过静脉注入氯化钾溶液将其处死，取下L4/L5/L6/L7节段的椎间盘(切下的范围包括前纵韧带、外层纤维环、纤维环穿刺道及部分髓核)，并根据标本来自间隙的不同，将标本分为L4/L5、L5/L6和L6/L73组。将取下的标本分别经固定、脱钙、石蜡包埋并切片之后，对组织病理切片HE 染色、Masson 三色胶原染色和番红O-固绿染色。观察3组椎间盘标本的组织学变化。

2 结 果

2.1 影像学观察结果

2.1.1 X 线结果

术后6 个月行腰椎X 线检查时发现，L4/L5和L6/L7椎间隙未见明显变化，无明显椎间隙变窄及椎体骨赘形成迹象，而L5/L6椎间隙则在术后6 个月与术前相比有明显椎间隙变窄和骨质增生反应(见图2)。

图2 DHI 变化Fig.2 Changes of DHI

2.1.2 MRI 检查

术前山羊腰椎序列整齐，椎间盘未见退变征象，椎间隙高度基本一致，术后6 个月复查可见腰椎序列紊乱，椎间盘出现高度丢失，体积缩小，椎体边缘骨桥形成等退变征象。MRI 高信号区面积变化见图3。

2.2 组织学观察结果

图3 MRI 高信号区面积变化Fig.3 Changes of hyperintense area in MRI

在术后6 个月将切下的椎间盘标本染色并在光学显微镜下观察发现，术后椎间盘即L5/L6椎间盘纤维环穿刺道内有明显的软骨样细胞增生，纤维排列杂乱，髓核含水量减少;而L4/L5和L6/L7椎间盘标本在光镜下观察发现，纤维环内外层始终分界清楚，表现为正常的板层样结构。3组椎间盘组织学评分变化见图4。

图4 椎间盘组织学评分变化Fig.4 Changes of histological scores of intervertebral discs

3 讨 论

椎间盘退变发生率高，危害较大，但确切的发生机制尚不完全清楚。生长因子在体外能控制细胞的增殖或分化，在体内能介导细胞之间的相互作用。它们不仅可以控制机体的发育、生长，还可控制组织的再生和创伤愈合.但也可促进组织的不正常改变。bFGF、TGF-β 通过各自的受体信号转导通路促进成纤维细胞和血管内皮细胞等间质细胞增殖和合成胶原蛋白，是对创伤修复具有重要调控作用的生长因子。bFGF 作为一种重要的促有丝分裂原，它可以直接作用于组织修复细胞(如成纤维细胞)周期，使细胞G1 期比例下降，S 期和G2+M 期比例增加，使细胞周期转换时间缩短，加速细胞的分裂和增殖。TGF-β 作为一种多功能生长因子，除作为化学催化剂催化炎性细胞与组织修复细胞向创面聚集外，本身还能直接作用于成纤维细胞，刺激细胞外基质中Ⅰ型前胶原合成、肉芽组织生长以及修复后期的组织重建等。TGF-β1 是蛋白多糖及胶原代谢等椎间盘细胞外基质的重要调节物质之一，在椎间盘退变过程中扮演重要角色，既具有诱导某些细胞的促凋亡反应，又能增强某些细胞的抗凋亡作用。

但外源性TGF-β1 和bFGF 注入正常椎间盘内，椎间盘会发生何种变化，目前尚无确切报告。本实验通过将外源性TGF-β1 注入羊L5/L6正常椎间盘内，L4/L5椎间盘注入0.2 mL 生理盐水作为正常对照，L6/L7椎间盘注入0.2 mL FGF 作为阳性对照。通过X 线片测量腰椎DHI，腰椎MRI T2 加权像测量椎间盘高信号区的面积和Msuda 椎间盘评分变化，结果显示:外源性TGF-β1 可以明显使椎间盘DHI 降低、核磁椎间盘高信号面积减少，椎间盘病理学评分增加。FGF组也有变化，但较TGF-β1组改变轻。

本研究结果显示外源性TGF-β1 注入正常椎间盘内，椎间盘会发生退行性改变。其原因可能是随着TGF-β1 浓度升高及其自分泌调控机制，TGF-β1在椎间盘中的含量也不断增多，其对胶原合成的正向调节作用不断增强，导致Ⅰ型胶原合成增加量进一步增加，并逐渐取代Ⅱ型胶原，使得髓核承受压力及形变能力降低，最终整个椎间盘发生纤维化。这也可能是TGF-β1 导致椎间盘退变机制之一。

另外，TGF-β1 注射进椎间盘内，激发其局部炎症血管反应，炎症部位的细胞大量产生生长因子，如bFGF 和CTGF 等，这些生长因子作用于与循环系统隔绝的椎间盘细胞，通过信号转导促进了椎间盘细胞的分化，可能导致椎间盘纤维化和退变。

本实验样本量较小，仍需同道对椎间盘退变的确切机制进行进一步研究。

［1］Peng B，Wu W，Hou S，et al.The pathogenesis of discogenic low back pain［J］.J Bone Joint Surg Br，2005，87(1):62-67.

［2］Peng B，Hou S，Wu W，et al.The pathogenesis and clinical significance of a high-intensity zone(HIZ)of lumbar intervertebral disc on MR imaging in the patient with discogenic low back pain［J］.Eur Spine J，2006，15(5):583-587.

［3］Peng B，Hao J，Hou S，et al.Possible pathogenesis of painful intervertebral disc degeneration［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2006，31(5):560-566.

［4］An HS，Takegami K，Kamada H，et al.Intradiscal administration of osteogenic protein-1 increases intervertebral disc height and proteoglycan content in the nucleus pulposus in normal adolescent rabbits［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):25-31.

［5］Masuda K，Aota Y，Muehleman C，et al.A novel rabbit model of mild，reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture:correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):5-14.