γ 射线照射对椎间盘生物学活性的影响

丁 宇，阮狄克，何 勍，王超锋

鉴于脊柱融合术后易导致邻近节段的退变，异体椎间盘移植(total disc allografting，TDA)等椎间关节成形术近年来得以快速发展，系列动物实验及一期临床研究均证实了TDA 作为自然生物椎间盘移植的有效性［1-2］。然而，异体组织材料在临床的应用过程中还应考虑到其安全性，即尽量减少诸如肝炎、HIV 等病毒，细菌或真菌等所致疾病传播的可能性。另外，随着椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)生物学治疗的发展，诸如组织工程构建椎间盘、基因治疗、间充质干细胞移植等均具有令人鼓舞的应用前景［3-4］，人们期望找到一种可靠的生物支架用于椎间盘疾病的相关研究。本研究通过比格犬动物实验，旨在评价经γ 射线照射致去细胞化异体椎间盘的生物学特性，进而探讨其作为生物椎间盘支架的可行性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

共选择6 只比格犬，动物实验方案事先得到医院动物实验道德委员会批准。所有犬实验前均行X线检查，以排除脊柱疾患的可能。应用超剂量戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉注射处死实验动物，并获取尽可能长的脊柱节段。

1.2 实验分组

胸腰椎脊柱节段被分解并随机分为4组:1 个对照组(椎间盘未被照射处理)及3 个处理组(不同剂量射线照射处理)。每组含有12 个实验样本，其中6 个样本用于细胞活性检测(主要为胸椎)，另外6 个样本用于生物力学测试(主要为腰椎)。射线照射剂量分为18 kGy，25 kGy 及50 kGy 3 个等级，照射完毕后各实验组标本立即送往细胞检测，并尽早行生物力学测试。

1.3 实验方法

1.3.1 椎间盘准备及冷冻

尽量去除脊柱标本周围的肌肉、韧带等附着组织，分别于距离上下终板1～2 mm 处截断椎体，实验过程中不断用0.9%生理盐水喷洒标本以保持其湿度。实验中采用逐级冷度的方法进行标本处理，首先将获取的椎间盘标本用生理盐水洗净，然后浸于RPMI-1640 冷冻保存液中(10% 二甲基亚砜+10%小牛血清)，处理后标本冷藏于4℃冰箱中。继而，标本保存在－15℃环境中1 h、－40℃环境中1 h，最终储存于－80℃低温冰柜中3周。

1.3.2 射线辐射

椎间盘接受60Co 源照射(北京大学钴源控制中心)，标本周围放置干冰以保持低温环境，控制照射剂量分别为18 kGy，25 kGy 及50 kGy。在照射过程中，将标本袋置于照射空间中心位置，以保证整个标本接受均匀强度的射线辐射处理，辐射量计放置于标本附近以检测实际辐射剂量。

1.3.3 移植椎间盘细胞活性的检测

用于细胞活性检测的椎间盘组织应及时严密包装，并于0.5 h 内送往检测实验室。将冻存管直接浸泡于37℃水浴中复温(复温速率约100 ℃/min)，取出椎间盘组织，冰冻切片厚度30 μm。加入5 mg/L的溴化乙锭(ethylene dibromide，EB)和50 mg/L的二醋酸荧光素(fluoresceindiacetate，FDA)各20 μL，加盖玻片，放入37℃恒温箱中避光孵育10 min，然后在荧光显微镜下观察软骨细胞膜的完整性。胞膜完整的髓核细胞将被FDA 染为绿色，胞膜破裂的髓核细胞被EB 染为橙色，计数每0.01 mm内绿染及橙染的细胞数，髓核细胞存活率为绿染细胞数/(绿染细胞数+橙染细胞数)。由于椎间盘组织包括纤维环及髓核，因此计数时将纤维环分为2 部分，即外侧纤维和与髓核相接的内层纤维环，每部分各计数5 个视野，取均数，髓核组织亦选取5 个视野计数。每一计数结果需通过肉眼观察验证，以尽可能减少由于“过度自动”检测所致读数偏差。另外，同时兼具绿染及橙染的细胞被视为活细胞。

1.3.4 生物力学测试

测试标本密封冷冻于－30℃冰柜里，测试前12 h置于室温融解。用特制尖头螺钉穿透椎间盘上下椎体，将标本固定于MTS 机(MTS 858 Mini BionixⅡ，Eden Prairie)测试夹具上，在动态运动采集系统软件的辅助下进行相关测试。根据椎间盘本身的生物学特性，设计测试不同实验组标本的机械强度及弹性变形能力并进行比较。首先，轴向位移设定为1 mm，予以测试标本纵向牵拉力及压应力;然后分别予以标本左/右5°旋转，测试其扭力矩(见图1)。每一次测试过程中取最大参数值。为尽可能减少系统误差，随机安排予以标本牵拉、压应力测试顺序及左/右旋转测试顺序，每一标本分别予以3 次完整测试，比较分析不同测试结果间的差异性，并取其平均值。在测试过程中不断喷洒0.9%生理盐水以维持标本的湿度。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0 软件进行统计分析，方差分析用以验证不同实验组变量的差异，各组统计数据以±s 表示。为减少个体差异及系统误差，细胞活性测试结果以百分比表示。应用非参数检验方法，Wilcoxon 秩检验用以比较2组间的统计差异，Kruskal-Wallis 检验用以2组以上的统计学比较。成对资料的t 检验用以同组间不同时段数据的分析比较。统计学水平取α=0.05。

2 结 果

荧光显微镜下各组椎间盘内细胞活性检测情况见图2。对照组纤维环及髓核细胞活性分别为92.6%、90.7%，18 kGy 照射组为76.5%、70.6%，25 kGy照射组为48.9%、50.7%，50 kGy 照射组为18.3%、10.1%(见表1，图3)。与对照组比较，所有照射组椎间盘纤维环及髓核的细胞活性均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);同时各处理组间细胞活性亦有明显差别，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示椎间盘接受γ 射线照射剂量与细胞活性水平呈负相关。

图1 椎间盘相关参数生物力学测试Fig.1 Biomechanical test analysis for Intervertebral disc

图2 荧光显微镜下观察椎间盘细胞活性(×200)Fig.2 Disc cell viability detected by fluorescence microscop(×200)

表1 各组椎间盘内细胞活性检测结果Tab.1 Cell viability in intervertebral disc of different groups

椎间盘施以纵向拉/压及左/右旋转位移运动后，测试标本未见解剖结构破坏，同一标本多次测试结果差异无统计学意义(P＞0.05)，提示相关参数设置合理。生物力学实验显示γ 射线照射后椎间盘的生物力学特性未见明显改变，各组间相应受力及扭力矩最大值均无明显差别，差异无统计学意义(P＞0.05)，相应统计数据及分析见表2。

图3 各实验组椎间盘细胞活性Fig.3 Cell viability in intervertebral disc treated with various doses of Gamma irradiation

3 讨 论

3.1 本研究的意义及特点

作为一种保留手术节段活动度的手术方式，椎间关节成形术避免了由既往融合术所致邻近节段的应力集中，从而避免了(至少是减低了)这些节段椎间盘退变加速的可能［5］。同人工椎间盘置换一样，异体椎间盘移植旨在重建椎间盘切除术后的脊柱稳定性、恢复节段活动度，动物实验及临床一期研究均证实了异体椎间盘移植的可行性［1-2］。异体椎间盘在一定程度上模拟正常椎间盘的生物力学状态、动力学应力状态及生理功能，具有良好的解剖学适配性、能够承受并传导正常的轴向挤压及扭转等生物力学应力。

异体组织器官移植的风险之一是传播相关疾病，如HIV、丙肝及乙肝等，尽管组织移植材料在处理、保存及运输方面都是严格遵守无菌原则的，但并不能完全消除这些处理过程中移植物被细菌或病毒污染的可能。因此异体组织库在处理骨肌肉移植材料时，除常规消毒灭菌处理及无菌操作外还使用(如γ 射线)照射等追加的保险措施，以期获得更高的安全性［6］。对异体移植物可能传播HIV 等疾病的顾虑也使γ 射线的应用日益普遍，它能够较理想地覆盖穿透移植物内所有组织结构，同时也是一种相对经济的方法。但是，有报道称在γ 射线消毒灭菌减少移植物传播疾病的同时，组织的生物学性能也可能会受到一定程度的影响［7］。

本研究的特点在于:①评价了经γ 射线照射处理后椎间盘的生物学性能。②成功制作了椎间盘自然支架模型，选择适宜的γ 射线辐射强度，使得椎间盘去细胞化的同时保留了组织生物力学性能，初步证实了去细胞化椎间盘作为自然支架应用于椎间盘疾病相关研究的可行性。

3.2 低温条件下异体椎间盘的保存和γ 射线照射处理过程

椎间盘移植过程中如何保持异体椎间盘细胞活性是一个棘手的问题。低温保存常被用于保护组织细胞，因为快速的冷冻会增加细胞内液的浓度及粘性，从而有助于保存细胞内水分、防止细胞快速皱缩［8］。低温保存前通常在4℃以下的10%的二甲基亚砜溶液中浸泡1～2 h，而后经过2 次冷却处理最终达到－80℃(有条件时再次冷冻保存至－196℃超低温环境)。应用逐级冷冻技术，可以使得椎间盘内细胞活性保持至24 个月，同时它的机械性能和稳定性都没有发生明显变化［9］。

电离辐射对组织及其他生物制剂的损伤机制主要包括直接作用和间接作用。直接作用是离子在遇到组织后发生共价键的断裂及外层电子的跃迁，从而直接释放出能量，造成组织的损伤。间接作用是γ 射线作用于水分子、氧气等产生自由基及活性氧等，作用于靶分子并对其化学结构造成不可逆损害，其中以OH-的破坏作用尤为突出;尽管自由基和活性氧只能存在较短的时间，但是它们具有极强的活性，大多数组织损伤都是由它们所造成的［10］。在低温环境下，产生的自由基数目相对较少，因此对组织造成的损伤也较少。本实验中，低温冷冻环境有利于保护椎间盘内的组织细胞，同时优化了γ 射线照射环境、减轻了对组织的损害。

表2 椎间盘体外生物力学测试结果Tab.2 Biomechanical test results of intervertebral disc

3.3 γ 射线照射处理椎间盘的细胞活性

椎间盘是由纤维环、髓核、软骨终板高度整合构成的异质体，最终它们作为一个高度整合的整体赋予了椎间盘在机体中独特的力学特性和生物学功能［11］。在尚未退变的椎间盘里，髓核是一个富含水、黏多糖、胶原及非胶原蛋白的有光泽的胶冻状结构;纤维环是一个有纤维软骨基质构成的环状结构，其中纤维与脊柱横截面成角28°～43°;上下软骨终板对营养物质的运输及代谢废物的清除起了至关重要的作用，同时由于软骨终板的多孔性及可渗透性，它们对液体的散布也起到了一定作用。

纤维环细胞起源于间充质，但是它同时也显示了一些纤维母细胞及软骨细胞的特性，例如它可以分泌Ⅰ型、Ⅱ型胶原，合成蛋白多糖。而越靠近内侧的纤维环，纤维环里的细胞越圆，细胞数量越少，纤维环细胞往往被富含Ⅲ型、Ⅳ型胶原的软骨基质所围绕。在早期的胚胎发育过程中，椎间盘的环状结构内外部分在细胞构成和形态方面有着显著的不同，环的外侧是一层层变成长形的细胞构成的，而内层细胞仍呈圆形的、软骨样细胞，没有形成层状结构，但是合成了大量的细胞外基质。髓核是从脊索分化而来的，在早期胚胎里，脊索来源的髓核细胞聚集在一起，细胞之间有缝隙连接，共同分泌一种半透明的、与成熟椎间盘不一样的基质，最终脊索细胞逐渐被圆形的、包埋在基质内的软骨样细胞所代替。

细胞活性水平取决于存活细胞和死亡细胞间的比例。研究显示，γ 射线对组织的损伤程度与照射剂量及照射时组织的物理状态有关。新鲜冷冻保存椎间盘后，纤维环及髓核内仍能保证有＞90%的细胞存活［9］。但经γ 射线照射后，存活细胞比例迅速减小，其中接受高剂量照射的椎间盘内存活细胞数量明显小于接受低剂量照射组。低剂量γ 射线照射的椎间盘内保留了较多存活的细胞，故而期望该组椎间盘移植后能够更好地承担生物学功能。尽管之前针对异体骨的实验建议首选中等照射剂量［12］，但是很难确定具有较低细胞活性的椎间盘能否承担理想的生物学功能，而接受高剂量照射的椎间盘可能更加难以完成最基本的生物学活动。

3.4 γ 射线照射对椎间盘机械性能的影响

对骨骼肌肉移植材料的消毒灭菌处理仍是一个极大的挑战，γ 射线应该能够穿透整个移植材料，在杀灭可能携带的病原微生物的同时，尽量保持异体组织生物学及机械性能。与椎间盘相类似，一些学者研究了γ 射线对肌腱、骨以及骨-肌腱-骨复合体生物力学特性的影响。总体来说，20 kGy 的放射剂量对所有类型的异体移植物都是安全可行的，对组织的机械性能不会产生严重的损伤。对医用材料来讲，通常＜20 kGy 的照射剂量就足以达到灭菌消毒目的，在20 kGy γ 射线作用下，大多数对射线敏感的细菌病毒(包括HIV 病毒)都能够被杀灭［13］。但为保险起见，国际原子能机构(international atomic energy agency，IAEA)推荐25 kGy 作为医用材料消毒灭菌的标准剂量，而大多数商业性异体组织库建议使用15～20 kGy 的照射剂量进行消毒灭菌。Vangsness 等［14］对36 家组织库的一项调查显示，大多组织库选择10～35 kGy 不等的γ 射线剂量。Fideler等［15］针对骨肌腱移植材料的研究显示，往往需要40 kGy 的照射强度才可能杀灭HIV、甲肝、丙肝及其他病毒微生物。而Grieb 等［16］建议的照射剂量高达50 kGy，单位面积内可以杀灭16 log10 耐药微生物、＞4.5 log10 辛德比斯病毒及4.9 log10 细小病毒。

选择合适的异体椎间盘应考虑到其初始的机械性能和植入后对应力的承受能力。本实验显示，各处理组与对照组椎间盘的生物力学特性是一致的，这是进行椎间盘体内移植的先决条件。经γ 射线处理的椎间盘能够较好地保持原有的机械性能及生物学特性，这无疑将为异体椎间盘提供一个全新的消毒灭菌方法。本研究通过体外实验评估了经γ射线处理的椎间盘的生物力学特性的变化，研究显示椎间盘在高达50 kGy 剂量(接近于常规剂量的3倍)照射后仍展现了良好的生物力学性能，在采取优化照射措施的前提下，达到消毒灭菌效果的同时对组织的伤害程度相对较小。

3.5 展望

目前，国内外很多学者都在试图找到一种修复退变性椎间盘的方法，提出了诸如基因治疗、生长因子注射、以细胞为基础的组织工程及细胞治疗等多种疗法。考虑到包括蛋白多糖及胶原等基质的减少为椎间盘退变的主要始动因素，研究人员通过植入能够产生基质的细胞来修复退变性椎间盘，即所谓的细胞治疗方法［17］。目前应用的细胞主要包括脊索髓核细胞、自体椎间盘软骨细胞、弹性软骨或肋软骨以及间充质干细胞等，实验结果令人振奋，从中看到了可以延缓椎间盘退行性变甚至重塑椎间盘组织的可能性。但是，还有一些问题亟待解决，包括如何建立可靠的椎间盘移植动物模型、细胞植入的最佳干预时机等。

适当剂量的γ 射线照射处理椎间盘，其内细胞活性仍可保持在一定的水平，同时无明显生物力学等机械性能的降低，提示经照射处理的异体椎间盘有可能作为自然支架为纤维环及髓核细胞的增殖提供理想的生理环境。但是，除了自由基的直接损害作用外，γ 射线还可造成对遗传物质核糖核酸的损伤，导致相关基因组的损伤及功能障碍，进而影响到体内实验中活性细胞的作用表达。因此，经γ 射线照射后异体椎间盘应用的确切效果有待体内动物实验进一步明确。一方面需要观察不同剂量照射处理的椎间盘移植后的生物学转归，即能否维持椎间盘高度及稳定性、能否保持手术节段的功能及活动度;另一方面需要进一步探讨自然椎间盘支架在椎间盘疾病相关研究中的实际应用价值，如去细胞化椎间盘能否为特定细胞提供理想的生存增殖环境。

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