幼鼠小肠缺血-再灌注肠组织的形态学观察

林春榕，潘 云，吴学东，曲文超，路会侠，庄立峰，刘庆文，盛 盼

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.大理学院附属医院，云南大理 671000）

幼鼠小肠缺血-再灌注肠组织的形态学观察

林春榕1，潘 云2，吴学东2，曲文超2，路会侠2，庄立峰2，刘庆文2，盛 盼2

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.大理学院附属医院，云南大理 671000）

目的：观察幼鼠小肠缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）肠组织形态学变化。方法：将32只4周龄（Sprague Dawley，SD）大鼠随机分成2组即假手术组（Sham组）和缺血-再灌注组（I/R组），每组各16只。Sham组仅暴露腹腔脏器，不作任何干预；I/R组经阻断肠系膜上动脉60 min后恢复血供，于再灌注30、60、90、120 min每组动物各处死4只取小肠组织进行组织学Chiu’s评分，结果进行单因素方差分析和组间t检验。结果：Sham组肠组织形态正常；I/R组小肠组织发生了明显的缺血和炎症反应并随再灌注时间延长而加重，各观察时间点组织学评分在组间比较差异均有统计学意义，各值在I/R组高于Sham组（P＜0.05）。结论：幼鼠肠I/R导致肠组织病理损伤并随再灌注时间延长而加重。

肠缺血-再灌注损伤；肠组织；组织学；幼鼠

肠缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）是小儿常见的问题〔1-3〕，尽管由于各种原因导致肠I/R所导致的肠道损伤已被广泛重视，但通常情况下难以获得肠I/R后的组织标本进行研究，因而对小儿肠I/ R肠组织损伤的变化规律和转归认识尚少，本研究利用幼鼠造成肠I/R模型并动态观察肠管I/R的后肠组织的形态学变化，以此阐述肠I/R对肠组织形态的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 4周龄健康（Sprague Dawley，SD）大鼠幼鼠共32只，雌雄不限，SPF级，动物编号：许可证SCXK（渝）2007-017，体重100±15 g。手术室温度25～27℃，相对湿度50%～65%。

1.1.2 实验试剂、器械、仪器 10%水合氯醛溶液（大理学院附属医院制剂室配制）；0.9%生理盐水；常用消毒剂；小手术器械及手术用品。

BM-Ⅷ生物组织包埋及冷冻机（孝感市宏业医用仪器有限公司），PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司），莱卡石蜡切片机（LE-ICARM2025型），OLYMPUSBX-41型多功能生物显微镜（日本奥林巴斯光学有限公司）和HMIAS-2000型高清晰医学彩色图象分析仪（武汉千屏影像公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 32只DS大鼠随机分为假手术组（Sham组）和I/R组，每组16只。

1.2.2 动物实验 用10%水合氯醛溶液腹腔内注射（3 mL/kg）麻醉后仰卧位固定，腹部去毛，消毒后取上腹正中纵行切口，依次切开入腹，寻找并游离肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA）根部，见图1。用橡皮条阻断肠系膜上动脉血流60 min，见图2。松开橡皮条，恢复肠系膜血流，造成小肠缺血-再灌注模型。Sham组动物在开腹后不做任何干预于I/R组再灌注后30、60、90、120 min时4个时间点每组各处死动物4只，取距回盲瓣5 cm处近端2 cm长的小肠标本备做组织学研究。

图1 寻及肠系膜上动脉

图2 阻断肠系膜上动脉血供

1.2.3 组织学观察 所取小肠组织制成6～8 μm厚度的切片后进行H-E染色，光镜下观察肠粘膜的形态学变化，每张切片随机选择镜下10视野（100×），肠粘膜损伤程度按Chiu氏6级评分法〔4-5〕进行组织病理评分：0级为正常肠粘膜绒毛结构，组织形态正常，记为0分；1级为肠粘膜绒毛顶端上皮下间隙增宽，肠壁组织水肿，记为1分；2级为绒毛上皮下间隙明显增宽，绒毛上皮与固有膜剥脱，记为2分；3级为绒毛上皮成块脱落，记为3分；4级为绒毛上皮完全脱落，固有膜结构裸露，记为4分；5级为固有膜结构崩解形成溃疡并出血，记为5分。

1.3 统计学处理 用SPSS11.0整理数据。各组资料以均数±标准差（±s）表示，组间进行单因素方差分析和组间t检验，组内比较采用配对t检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

本实验共用动物32只，I/R组经夹闭肠系膜上动脉后相应肠系膜血管搏动消失，肠管颜色苍白并逐渐转变为暗紫色，见图3。缺血60 min后恢复血供，在再灌注后30 min肠管颜色逐渐恢复的同时逐渐出现肠壁充血水肿并不断加重，至再灌注90 min时肠管呈现暗紫色形如缺血60 min时的改变，见图4。继之肠管颜色逐渐好转，直至120 min时肠管色泽恢复但水肿仍然较为明显。

图3 小肠缺血再灌注模型

图4 小肠缺血后再灌注90 min的肠管改变

2.1 组织学观察结果 Sham组肠组织无水肿及出血，肠管各层及肠组织内各结构正常。见图5。

I/R组在再灌注30 min的肠组织可见充血水肿，而在60 min及以后2个时间点出现小肠绒毛脱落和缺损、点状出血和溃疡形成、粘膜不同程度的绒毛排列紊乱和组织内炎性细胞浸润，其中再灌注以90 min时最为明显，呈现明显的粘膜上皮脱落，溃疡形成并出血，肠组织内炎性细胞浸润和组织结构松散。见图6。120 min时肠组织形态无明显改善，但溃疡和出血情况也无明显加重。

图5 正常肠粘膜（HE×100）Chiu氏评分0分

图6 缺血再灌注组肠粘膜（HE×100）Chiu氏评分5分

2.2 肠粘膜损伤程度的Chiu氏6级评分 通过对小肠组织进行病理损伤的Chiu氏6级评分，获得各组各时间点的平均分值。见表1。Sham组各时间点的评分值变化较小，而各时间点I/R组的评分值均较Sham组增高，并呈现逐渐增高的趋势，其中以再灌注90 min时为最高，120 min时有所回降。

表1 各组各时间点小肠粘膜损伤病理Chiu氏评分结果

Chiu’s评分值在组间比较经单因素方差分析和组间各相应时间点评分值比较经t检验差异均有统计学意义，I/R组的评分明显高于Sham组（P＜0.05）；在组内各时间点Chiu’s评分值比较，Sham组各时间点测得值间的差异无统计学意义（P＞0.05），而在I/R组内比较差异有统计学意义（P＜0.05），但仅在60、90和120 min时的评分高于30 min时的评分值，而评分值在60、90、120 min 3个时间点间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

肠I/R是常见的临床问题，也是小儿外科常见的临床现象。肠扭转、嵌顿疝、肠套叠、粘连带压迫、肠内粪石或蛔虫团块等多种原因所致肠梗阻和小肠移植、失血性休克等均造成肠缺血，在肠梗阻整复和、休克复苏后使肠管血供恢复即形成肠I/R。肠缺血将造成不同程度的组织损伤，而再灌注后肠组织在原缺血造成损伤的基础上组织损伤将进一步加重，则形成再灌注损伤。肠道的血供丰富因而对缺血缺氧十分敏感，是再灌注损伤时最易受累的器官之一，然而肠道又是大量细菌及其代谢产物内毒素的贮存场所，肠I/R不仅可导致肠道损伤还可导致远隔器官的损伤，甚至发生多系统和器官功能衰竭〔6-7〕。因此，进行肠I/R肠组织形态学研究对进一步研究和认识小儿肠I/R损伤及其发生机制有重要的意义。

本实验利用幼鼠制作肠I/R模型，在结扎肠系膜上动脉阻断小肠血供1 h后恢复血流灌注，肠管色泽好转，但再灌注90 min时肠管再度呈现缺血的改变；在再灌注的120 min观察期内，肠管水肿进行性加重，而Sham组肠管外观无明显变化。组织学上呈现缺血和炎症的改变并随再灌注时间延长而加重，其中以再灌注90 min时改变最为明显，对组织学损伤程度的Chiu氏评分结果与肠管大体和镜下改变相吻合。实验结果表明，幼鼠小肠缺血1 h恢复血供后，肠组织缺血的状况并不随着血供恢复而迅速改善，而是呈现缺血的后果—坏死逐渐变得明显，随着再灌注时间延长出现粘膜点状出血和溃疡形成；在再灌注过程中，肠组织发生了炎症反应，出现组织充血、水肿、渗出、坏死和炎性细胞浸润的病理过程。如果说缺血的改变源于肠系膜血供的中断，并在再灌注过程中逐渐表现出来，而组织坏死脱落需要时间，因而表现为再灌注过程中缺血的改变逐渐加重，那么炎症反应则是在缺血基础上组织发动的另一病理过程，这一过程造成了新的更严重的变化，表现为肠管缺血—好转—再缺血—最终好转。出现再缺血的现象可能归结于“无复流现象（no-reflow phenomenon）”〔7〕。

本实验观察再灌注时间虽较短，但却发生了肠组织形态的转折性变化，这可能与动物年龄和处理因素有关。由于幼年动物机体的防御机制发育并不完善，且组织中水的含量大于成年动物，加之幼年动物的修复能力较强，一旦有损伤因素存在组织将发生快速而明显的反应，而一旦损伤因素去除，修复也比较快。有对肝脏I/R损伤的研究表明，幼年动物的病理改变较成年动物的改变轻〔8〕。本实验仅阻断幼鼠小肠动脉血供，而在临床各种原因导致小儿肠I/R损伤往往都是先发生静脉回流障碍，继之动脉血供中断，患儿肠管的病理变化应该更为明显而且病理过程更长。有学者通过动物实验观察到，在相同的观察时间内，不同的处理因素获得的病理改变程度也不一致，其中阻断动脉血供的病理改变较阻断静脉或动静脉同时阻断的变化要轻〔9〕。基于以上原因，在本实验观察到再灌注过程中幼鼠肠管出现一过性再缺血的现象。

研究表明，幼鼠肠I/R导致肠组织缺血性损伤的同时发生了炎症反应并随再灌注时间延长而加重，但其机制尚未完全明了，有待进一步研究。

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Histological Study of Intestine with Ischemia/Reperfusion Injury in Young Rats

LIN Chunrong1,PAN Yun2,WU Xuedong2,QU Wenchao2,LU Huixia2,ZHUANG Lifeng2,LIU Qingwen2，SHENG Pan2
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To explore the intestinal histological changes of intestinal ischemic/reperfusion（I/R）injury in young rats. Methods:32 Sprague Dawley（SD）rats at 4 weeks old were divided into 2 groups with 16 in each group randomly,and there were sham operated group as a control and I/R group.The abdominal cavity were exposed in all rats but not any intervene in sham group, the superior mesenteric artery were occluded in I/R group for 60 min and followed by 30 min,60 min,90 min and 120 min for reperfusion and 4 rats were harvested at each time point.The intestine specimens were obtained for pathological study and determination of histopathologic score.The data were analyzed statistically.Results:There were pathological changes of ischemia and inflammatory obviously and getting severer with the reperfusion time prolong in all rats but in the sham group.There was statistical significance as a result of the Chiu's score between two groups in every time point（P＜0.05）.The scores in I/R group were higher than that in sham group（P＜0.05）.The score was highest at 90min among four time points in each I/R group.Conclusion:The pathological changes of intestinal injury caused by I/R were getting severer with reperfusion prolong.

intestinal ischemia-reperfusion injury；intestine；histology；young rat

Q463［文献标志码］A［文章编号］1672-2345（2012）03-0024-04

云南省自然科学基金资助项目（2009ZC121M）

2011-12-31

2012-03-06

林春榕，副教授，主要从事生物化学与分子生物学研究.

（责任编辑 董 杰）