直投式发酵剂制备的哈尔滨风干肠在成熟过程中的理化及微生物特性变化

孔保华，夏 让，夏秀芳，刁新平

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030; 2.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨150030)

直投式发酵剂制备的哈尔滨风干肠在成熟过程中的理化及微生物特性变化

孔保华1，夏 让1，夏秀芳1，刁新平2

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030; 2.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨150030)

采用三种由自然发酵分离鉴定出的微生物，按一定比例混合制备复合发酵剂，将其用于哈尔滨风干肠中，研究其对风干肠的理化性质、微生物变化和游离氨基酸含量的影响。实验分为三组，分别为对照组，添加普通发酵剂组和添加直投式发酵剂组。结果表明:添加发酵剂的风干肠pH明显低于对照组，且添加直投式发酵剂的pH最低(P＜0.05);添加发酵剂会使产品的游离氨基酸含量显著提高(P＜0.05)、感官品质也较好(P＜0.05)，而各组水分活度变化差异不明显，这说明直投式发酵剂具有很好的活力和发酵性能，能够显著提高风干肠的质量，缩短发酵时间。

发酵风干肠，微生物，理化特性，发酵剂

乳酸菌发酵生产的发酵香肠是一类发展前景广阔的肉制品。中式发酵香肠便是其中一种重要的传统发酵肉制品［1］。将乳酸菌发酵剂添加在风干肠中可改善产品品质、缩短产品生产周期［2］。乳酸菌是肉制品中常用的发酵剂，近几年也有很多关于酵母菌和葡萄球菌做发酵剂的报道［3－4］。乳酸菌和酵母混合发酵能使产品形成很好的风味，并使色泽稳定;也有利用葡萄球菌和酵母菌复合做发酵剂的报道［5］。发酵剂混合使用，更能使发酵香肠的优势得到充分体现。利用从肉制品中分离出来的乳酸菌生产发酵肉制品，产品的质量得到改善，产品的风味和色泽也发生变化，能够延长产品保藏期，抑制有害菌的增殖，防止肠毒素的产生，这一方式在欧美国家中已被广泛使用［6］。Erkkilä等将乳酸菌接种于发酵肠中，乳酸菌很容易大量繁殖成为优势菌群［7］，制得的发酵肉制品pH相对较低，但不太适应中国人的口味。本实验利用从自然发酵哈尔滨风干肠中分离纯化出的一株乳杆菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4，通过添加冻干保护剂、冻干浓缩制备直投式复合发酵剂。利用乳酸菌发酵可以使产品产生独特的风味、颜色和质地［8］。乳杆菌 L5可快速降低产品的pH，起到调节制品pH的作用，长期寄居在人体内，还能调节肠道菌群［9］。葡萄球菌S2能促进肌肉蛋白质降解为氨基酸，对产品风味的形成有一定的促进作用［10］。在肠表面接种酵母菌，可使产品表面产生一种白色物质［11］，产生酵母味。本实验将直投式复合发酵剂应用于风干肠中，探讨制品在发酵干燥过程中pH、水分含量、Aw和游离氨基酸的变化，以研究复合式直投式发酵剂对风干肠综合品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

从自然发酵的风干肠中分离鉴定的三种菌，包括一株乳杆菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4 以上菌种保藏于东北农业大学畜产品加工实验室，是本实验室从发酵肉制品中提取并分离，经过鉴定，在本实验中使用;MRS(Man Rogosa and Sharp)培养基 参照GB4789.2－2003，用于活化培养乳酸菌; MSA(Manntilo Salt Agar)培养基 参照GB4789.2－2003，用于葡萄球菌的活化、传代及制备发酵剂;麦芽汁培养基(Malt Extract Agar，MA) 用于活化培养酵母菌及制备发酵剂;健康新鲜的瘦肉(猪臀肉)、肥肉(背膘脂肪)、麯酒(玉泉大麯)、糖、姜、淀粉、味素、盐、桂皮、花椒、大料、丁香等及猪小肠衣 均为市售。

SYQ－DSX－280B高压蒸汽灭菌锅 上海申安医用仪器厂;AL104精密电子天平、DELTA 320pH计上海梅特勒－托利多仪器有限公司;ZE6000色差计日本色电工业株式会社;DHP－9272电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;智能水分活度仪Decagon Devices公司;ZHJH－1109超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;HBM－400B样品均质器 天津市恒奥科技发展有限公司;GL－21M冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SPX－250B－D摇床培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵剂的制备 将各菌种分别在各自的培养基活化并扩大培养。乳杆菌培养条件:37℃，17h;葡萄球菌培养条件:32℃，17h;酵母菌培养条件: 37℃，15h。

根据本实验室前期的实验结果，综合考虑各种菌种的发酵特性，配制复合发酵剂［12］。该发酵剂由从传统发酵风干肠中分离得到的一株乳杆菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4组成。其中一个实验组为将以上菌种离心制得菌泥投入到肠中，另一个实验组为将以上菌种离心得到的菌泥添加冻干保护剂，经过真空冻干制得菌粉添加到肠中。

1.2.2 发酵风干肠的制备

1.2.2.1 配料 瘦肉(猪臀肉)90kg，肥肉(猪背脂) 10kg，麯酒(玉泉大麯，)500mL，糖0.5kg，姜0.5kg，淀粉0.5kg，味素0.15kg，盐2.0kg，混合调料0.2kg(混合调料包括桂皮，花椒，大料，丁香等)。

1.2.2.2 发酵风干肠生产的工艺流程 新鲜原料肉(剔除淋巴，筋腱，血管等结缔组织)→绞肉(瘦肉切块，肥肉切丁)→腌制(加盐和亚硝)→加调味料(发酵风干肠加发酵剂)→拌馅→灌制→发酵(30℃，3d)→风干→捆把→蒸煮15min→成品。

1.2.2.3 样品的处理 选择3组样品处理，一组为自然发酵风干肠的对照组，一组为添加普通发酵剂(添加液体菌种)的实验组，一组为添加直投式发酵剂(添加菌粉)的实验组，使得两组添加菌种的实验组每克肉中分别含有乳杆菌L5的数量约为106cfu/g、葡萄球菌S2和酵母菌Y4的数量约为107cfu/g，将菌种按上述添加量添加到肉中，充分混匀。将接种菌种的风干肠在30℃发酵72h。对照组不添加任何发酵剂只添加配料，置于30℃发酵72h。分别在0、24、48、72h进行各种指标的的测定。

1.2.3 pH的测定 GB/T 9695.5－2008，剥去肠衣，取肠体中心的肉样10g，添加90mL预冷的蒸馏水，使用样品匀质器匀浆，使用pH计测定。

1.2.4 水分含量的测定 采用直接烘干法。

1.2.5 水分活度(Aw)的测定 将样品在室温下切碎，铺满样品盒的底部，使用水分活度仪测定。

1.2.6 色差的测定 将待测样品用绞肉机绞碎后，用 ZE6000色差计测定。白板 X为 90.18，Y为95.08，Z为103.29。采用D65光源，2°视角，30mm聚光镜测定。重复三次，取平均值。

1.2.7 感官评定 由本实验室研究生组成7人感官评定小组。在进行评定前要对评定小组进行培训，统一评定标准。将待检样品煮制15min，随机编号放入托盘中，进行评价。评定指标包括风味、酸败味、酸味、回味(品尝以后口腔残存的味道)［13］、咀嚼性、颜色、嫩度和总体可接受性。对于风味，7分为具有发酵风干肠特有的风味，1分风味较差;对于酸败味，1分为酸败味不可察觉，7分为酸败味浓重;对于酸味，7分为发酵肉制品适度的酸味，1分为几乎没有酸味或过酸;对于回味，7分为有较强回味，1分为几乎没有回味;对于咀嚼性，7分为风干肠具有适当的肉类咀嚼性，1分为咀嚼性较差;对于颜色，7分为风干肠正常的发红颜色，1分为颜色较差，出现异色;对于嫩度，7分为硬度适口，1分为过硬;对于总体可接受性，7分为可接受性高，1分为可接受性低。

1.2.8 菌相的变化 采用稀释平板计数法［14］。在无菌条件下用无菌生理盐水将菌液以10倍的倍数依次递增稀释至适宜稀释度，选择3个合适稀释度接种于相应固体平板(每个稀释度做3次平行)，并用无菌涂布棒将其充分涂抹均匀，将乳杆菌L5和酵母菌Y4置于35～37℃，葡萄球菌S2置于32～35℃恒温培养箱中培养(48±2)h后取出计数菌落数。

1.2.9 游离氨基酸的分析 样品经脱脂后，干燥研碎，用80%乙醇，超声波浸提，定容100mL后，用氨基酸自动分析仪分析。按GB/T18246－2000执行，由黑龙江省兽药饲料监察所完成。

1.2.10 统计分析 所得数据为三次重复实验的平均值。使用Sigmaplot 9.0作图，使用Statistix 8.1进行统计分析，并进行多重比较(P＜0.05)。

2 结果与讨论

2.1 发酵剂对发酵风干肠pH的影响

由图1可以看出，添加复合发酵剂的实验组和对照组的pH均呈现下降趋势，下降幅度存在很大差异。自然发酵风干肠的pH呈现先小幅上升后缓慢下降的趋势，这是由于在自然发酵的前期，乳酸菌的生长处于迟缓期，产酸较少，此时蛋白酶在肉中降解产生非蛋白氮［10］，使pH缓慢回升。随着发酵的进行，乳酸菌大量生长，pH降低。添加发酵剂的实验组pH持续降低，这是因为添加发酵剂的风干肠在发酵初期，乳酸菌即为优势菌大量生长，代谢碳水化合物产生乳酸，使pH始终处于下降的状态，发酵肠的最终pH降至5.4左右对实际生产有利［15］。同时，添加菌粉发酵剂的实验组比添加液体发酵剂的实验组pH降低快，这可能是由于菌粉中含有的保护剂有促进菌种生长的因子，在适当的条件下，菌体大量繁殖。

图1 添加发酵剂对风干肠pH的影响Fig.1 The influence of direct vat starter on pH of Harbin sausage

2.2 发酵剂对发酵风干肠水分含量和水分活度(Aw)的影响

从图2中可以看出不同处理组的水分含量和水分活度均呈持续下降的趋势，水分含量随着发酵时间的延长，降低幅度有所不同，但差异不大，添加发酵剂的各实验组水分含量低于自然发酵的对照组。这可能与pH的变化有关，随发酵的进行，乳酸菌代谢碳水化合物产酸，pH下降，添加菌粉发酵剂的实验组pH接近肌肉蛋白等电点(pI=5.4)，此时蛋白的保水能力较差，结合水转化为自由水，加快肠体表面水分向外界环境中扩散的速度。

图2 添加发酵剂对风干肠水分含量和水分活度的影响Fig.2 The influence of direct vat starter on water content and Aw of sausage

发酵肉制品的发酵过程常常伴随着水分活度的降低。低水分活度也是发酵肉制品货架期长和食用安全性高的一个因素。从图2中可以看出，实验组和对照组的水分活度变化趋势是一致的，但下降的幅度有所不同。自然发酵的风干肠水分活度下降速度较慢，添加复合菌种发酵剂的实验组，水分活度下降较快;而添加菌粉发酵剂的实验组水分活度下降则相对更快，72h时出现明显差异(P＜0.05)。这与pH的降低有关，pH下降，导致肌肉蛋白保水能力减弱，游离出自由水，加快了风干肠的干燥速度，使水分活度降低，减少微生物能利用的水分，而且在酸性条件下病原菌及腐败菌的生长受到抑制［16］，有助于实际的生产应用。

2.3 发酵剂对发酵风干肠色差的影响

图3为添加复合发酵剂实验组的色差变化曲线图，由图3可以看出，添加发酵剂的风干肠和自然发酵风干肠的亮度(L*值)和红度(a*值)总体上都呈现上升趋势。添加菌粉发酵剂的风干肠的L*值和a*值都高于其他两组，主要是由于菌粉中含有益菌因子，促进乳酸菌和葡萄球菌的生长，由于葡萄球菌具有增色作用，所以葡萄球菌大量生长繁殖时，促进发色，使得肠体色泽较好。而在发酵后期，添加菌粉发酵剂的风干肠的L*值和a*值又有下降趋势，可能是因为在发酵后期，乳酸菌繁殖，积累大量乳酸，pH过低，抑制葡萄球菌的生长，所以使风干肠的颜色受到影响。

图3 接种发酵剂风干肠L*值和a*值的变化情况Fig.3 The changes of L*values and a*values in fermented sausages with direct vat starter

2.4 发酵剂对于风干肠感官评定的影响

从表1中可以看出添加发酵剂的实验组各组的感官指标均好于自然发酵组，并且添加直投式发酵剂的实验组酸味、咀嚼性和总体可接受性要显著好于(P＜0.05)添加普通发酵剂的实验组。这可能是由于在发酵过程中，菌粉中的冻干保护剂含有利于菌株增殖的因子，促使菌株快速生长，加快产品风味的形成。乳酸菌发酵糖类产生乳酸，降低产品pH，当pH降低，接近肌肉蛋白的等电点(pI=5.4)时，在酸性条件下肌肉蛋白形成胶状组织，增加肉块间的粘着力，提高肉制品的弹性，组织细腻，口感也有所提高。所以经乳酸菌发酵的食品具有独特的风味［17］。各组产品均不产生任何酸败味，产品在发酵过程中都以乳酸菌为优势菌，抑制其他有害菌生长。添加发酵剂的各组均有适当的酸味主要是由于乳酸菌发酵产生乳酸，乳酸大量积累，适当的酸味促进产品风味的形成，过酸则会降低产品品质，使消费者难以接受。乳酸菌对产品颜色和嫩度的影响不大，主要是由于肠体内酸性环境有效地抑制了葡萄球菌的生长。

表1 添加发酵剂生产的风干肠的感官评价Table 1 The sensory evaluation of fermented sausage with direct vat starter

2.5 发酵剂对发酵风干肠菌数的变化

图4为添加菌粉发酵剂的风干肠及添加菌液发酵剂的风干肠中乳酸菌菌数、葡萄球菌菌数和酵母菌菌数的变化曲线图。由图4可以看出，随着发酵时间的延长，两个处理组的乳酸菌经历了一个先增加后减小的过程，添加菌液发酵剂的风干肠中葡萄球菌和酵母菌在0～48h都呈增长趋势，之后菌数逐渐减少;而添加菌粉的处理组在发酵0～24h时葡萄球菌和酵母菌的菌数是逐渐增加的，随着发酵的继续，菌数呈现持续下降状态。这可能是由于在发酵过程中，添加菌粉发酵剂风干肠中的乳酸菌较菌液发酵剂风干肠的增殖速度快，在短期内大量增殖，产生大量乳酸，很快成为优势菌抑制葡萄球菌和酵母菌的生长。而添加菌液的处理组在发酵初期，乳酸菌生长相对缓慢，肠体内的酸性环境较弱，葡萄球菌和酵母菌仍能小幅增殖，在发酵至48h积累大量乳酸，抑制葡萄球菌和酵母菌的生长，菌数降低。

图4 添加发酵剂对风干肠菌数的影响Fig.4 Effect of different fermented sausages on strain number

2.6 风干肠中游离氨基酸的变化分析

由表2中可以看出，添加发酵剂的实验组游离氨基酸的水平显著高于对照组。表明发酵剂中的葡萄球菌在发酵过程中迅速繁殖，加速蛋白质的水解，与许多研究的观点一致［18］。游离氨基酸与滋味直接相关，游离氨基酸通过降解形成风味化合物的前体，对风味的形成有重要作用。

表2 风干肠中游离氨基酸的变化情况(mg/100g)Table 2 The changes of free amino acid in different fermented sausages(mg/100g)

从表2中可以看出，添加菌粉的发酵风干肠中游离氨基酸的含量高于添加菌液的风干肠，更高于自然发酵的风干肠。这可能是由于菌粉发酵剂中含有促生长因子，在适宜的条件下，葡萄球菌就会快速增殖，迅速分解肠体中的蛋白质。谷氨酸是含量最高的氨基酸，谷氨酸是非常重要的鲜味物质，其含量提高有助于改善产品的最终风味。在发酵风干肠中，天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸是含量较高的氨基酸，他们的共同作用形成了风干肠的综合风味。

3 结论

采用直投式发酵剂制成菌粉生产风干肠，其pH在72h内降低至5.2，提高了产品的食用安全性和贮藏性，比自然发酵风干肠具有明显优势。添加发酵剂的实验组和自然发酵的对照组的水分活度变化差异不明显，但添加发酵剂的风干肠其游离氨基酸含量明显高于自然发酵组，游离氨基酸含量的增加有利于改善和提高产品风味，添加发酵剂实验组的产品总体可接受性要优于对照组，同时添加发酵剂的实验组明显缩短了发酵周期，赋予产品特有的发酵风味。

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Changes in microbial and physiochemical properties of Harbin traditional drying sausage prepared by direct vat starter during the ripening process

KONG Bao－hua1，XIA Rang1，XIA Xiu－fang1，DIAO Xin－ping2
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.College of Animal Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The mixture of three microorganism identified from natural fermented Chinese sausage was used to produce Harbin fermented sausage.The changes of microbflora，physico－chemical properties and the contents of free amino acid were analyzed.There were three treatments of sausages，including control group，adding the normal starter group，and adding direct vat starter group.The results showed that compared with those of control group，the value of pH in experimental groups decreased apparently，and the pH(with direct vat starter)was the least(P＜0.05)，the contents of free amino acids in products increased significantly(P＜0.05)adding starters.There was no obvious difference between water activity with experimental groups and control group.Sensory characteristics of experimental group(with direct vat starter)were improved significantly(P＜0.05).It was indicated that the direct vat starter prepared with great vitality and work performance could improve significantly the quality of Harbin traditional sausage and shorten the fermented time.

fermented sausage;microbiology;physiochemical properties;starter culture

TS251.6+5

A

1002－0306(2012)08－0168－05

2011－03－25

孔保华(1963－)，女，教授，博士生导师，研究方向:畜产品加工。

东北农业大学创新专项基金(20090301);国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903012－02)。