新疆伽师瓜采后贮藏中病原菌的筛选与初步鉴定

王坚，单春会，童军茂，唐凤仙，谢龙

（石河子大学食品学院，石河子832003）

伽师瓜是新疆特色资源，深受消费者青睐［1］，但致腐病原菌作为影响伽师瓜贮藏品质的主要因素正受到人们日益关注［2］。采后伽师瓜腐烂的主要病原菌的确定可以为采用生物防治及其它方法更有效地抑制新疆伽师瓜的腐败变质，延长伽师瓜的贮藏保鲜期，提高伽师瓜的经济价值提供参考依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料

伽师瓜采摘于新疆阿勒泰地区。

1.1.2试剂与仪器

主要试剂：氢氧化钠（分析纯），过氧化氢，乳酸－石碳酸棉蓝染色试剂等。

主要仪器设备：数显不锈钢电热培养箱，生化培养箱，显微镜，电热恒温干燥箱，冰箱，移液器，紫外可见分光光度计，超净工作台等。

1.2 方法

1.2.1培养基

采用PDA培养基［3］：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃，灭菌20min。

1.2.2病原菌的分离纯化

参照文献［4］选取。伽师瓜腐烂组织。在无菌条件下，切取约1cm3的腐烂果肉，放入装有浓度为0.85%的生理盐水中，于常温下进行摇床处理使微生物细胞分散均匀。用无菌移液器吸取菌悬液制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8等一系列样品稀释液［5］。

用无菌移液器吸取0.1mL不同稀释浓度的菌悬液接种在培养基中，每个稀释度设3个重复。待长出菌落后，进行划线分离，直至获得特性稳定的单菌落。根据形态进行初步分类、编号。

1.2.3主要致病菌的确定

于无菌操作间，将新鲜新疆伽师瓜用打孔器在伽师瓜腰部对称打出若干小孔。在打孔处分别接入浓度为10－5、10－6、10－7所筛选的病原菌孢子悬浮液。用PE保鲜袋将接病原菌的新疆伽师瓜包裹，并于28℃下恒温放置，24h后开始观察结果。每组设2个平行，根据腐烂情况最终确定该菌是否为主要致病菌。

1.2.4主要致病菌的初步鉴定

1.2.4.1 菌落形态观察 观察菌落的形状、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。菌落特征的描述参照《真菌鉴定手册》［6］。

1.2.4.2 显微镜下形态观察 霉菌进行乳酸－石碳酸染色后进行镜检。

2 结果与分析

2.1 致病菌的分离筛选

伽师瓜主要有4种腐烂类型［7］。

分别选取上述4种腐烂类型的新疆伽师瓜，进行致病菌的筛选分离、纯化，最终得到14株具有不同特征的微生物，符合4种腐烂类型的菌株数目依次为2、4、2、6株。

2.2 主要致病菌的确定

将筛选所得的14株微生物作为对象菌进行致病性检测，同时以不接菌和无菌水清洗伽师瓜表皮所得到的溶液（简称洗瓜原液）作为对照。实验结果见表2。

表2 致病性检测结果Tab.2 Test results of pathogenesis

根据观察结果（图1）可以看出：接入P4、P5、P6、P7、P8以及洗瓜原液均能引起伽师瓜的腐烂，其中以接入P7菌腐烂速度最快，腐烂情况最为严重。初步判断P4、P5、P6、P7、P8有可能是采后引起伽师瓜腐烂的主要致病菌。

与自然状态下腐败伽师瓜表面菌落比较，发现筛选出的菌种可以使新疆伽师瓜致病致腐，见图1。

根据以上实验结果，最终确定P4、P5、P6、P7、P8为引起伽师瓜采后腐烂的主要致病菌。

图1 菌株P4、P5、P6、P7、P8在瓜体上形态Fig.1 Forms of Srain P4、P5、P6、P7、P8on melon

2.3 主要致病菌形态特征

2.3.1菌株P4的初步鉴定

结果见图2。图2显示：菌株P4表面为青色，菌落成片生长，菌落呈粉末状，无菌丝，有明显的霉味，28℃培养48h菌落直径为15.3mm，经乳酸－石碳酸染色后经过镜检发现，分生孢子梗的顶端并不膨大，有指状分枝，且有可以再分的分枝，查询相关鉴定手册［7］可知P4为一种扩张青霉，属于曲霉科青霉属。

图2 菌种P4菌落形态（A）和光学显微镜镜检图（B）Fig.2 Colony morphology（A）and Optical microscope diagram （B）of Srain P4

2.3.2 菌株P5的初步鉴定

结果见图3。图3显示：菌株P5从培养基背面观察中心为粉红色，菌落呈圆形，菌落表面为绒状，菌丝紧密隆起，表面有2～3mm长菌丝，菌丝为白色，霉味不明显，28℃培养48h菌落直径为21.4 mm，基本不产生分生无孢子，查询相关鉴定手册可知P5属于毛霉属。

图3 菌种P5的菌落形态正面（A）背面（B）和光学显微镜镜检图（C）Fig.3 Both sides of colony morphology（A，B）and Optical microscope diagram （C）of Srain P5

2.3.3 菌株P6的初步鉴定

结果见图4。图4显示：菌株P6，表面为绿色的颗粒，菌落为青绿色，菌落表面为绒状，菌丝疏松隆起，霉味不明显，28℃培养48h菌落直径为11.3 mm，24h产生大量绿色分生孢子，经乳酸－石碳酸染色后经过镜检发现，孢子梗顶端膨大成圆形或者是椭圆形，经过查询相关鉴定手册可知P6属于曲霉科曲霉属。

图4 菌种P6的菌落形态（A）及光学显微镜镜检图（B）Fig.4 Colony morphology（A）and optical microscope diagram（B）of Srain P6

2.3.4菌株P7初步鉴定

结果见图5。图5显示：菌株P7菌落呈圆形，黑色的菌落，菌落表面为绒状，菌丝疏松隆起，有约1mm长菌丝，菌丝为黑色，霉味不明显，28℃培养48h菌落直径为10.3mm，24h产生黑色孢子，由形态将其归类为曲霉科曲霉属［9］。

图5 菌种P7的菌落形态（A）和光学显微镜镜检图（B）Fig.5 Colony morphology（A）and optical microscope diagram（B）of Srain P7

2.3.5菌株P8的初步鉴定

结果见图6。图6显示：P8菌落呈圆形，白色的菌落，菌落表面为绒状，菌丝紧密隆起，有约3～4 mm长菌丝，菌丝为白色，霉味不明显，28℃培养48 h菌落直径为20.6mm，基本不产生分生孢子，孢子囊梗为单生，菌丝发达，查询相关鉴定手册可知P8属于毛霉属。

图6 菌种P8的菌落形态正面（A）背面（B）和光学显微镜镜检图（C）Fig.6 Both sides of colony morphology（A，B）and Optical microscope diagram （C）of Srain P8

3 结论

对新疆伽师瓜样品腐败组织进行梯度稀释后，分离纯化，最终确定5株为主要致病菌，分别为P4、P5、P6、P7、P8。经乳酸－石碳酸染色后进行镜检，初步确定P4为扩张青霉，属于曲霉科青霉属；P5属于毛霉属；P6属于曲霉科曲霉属；P7为曲霉科曲霉属；P8属于毛霉属。

［1］姜海荣，尹琳琳，陈计峦.新鲜哈密瓜汁中芽胞菌的分离鉴定及超高压对其致死效应研究［J］.石河子大学学报：自然科学版，2010，28（1）：91－95.

［2］裴世琪，童军茂，寇霄腾，等.拮抗酵母茵对哈密瓜采后病害抑制效果的初步研究［J］.安徽农学通报，2009，15（1）：134－135.

［3］陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京：中国农业出版社，1995：93－103.

［4］芦云，罗明.哈密瓜内生细菌的分离及拮抗菌的筛选［J］.石河子大学学报：自然科学版，2004，7（22）：104－109.

［5］蒲彬，刘雪山.哈密瓜贮藏保鲜及防腐技术［J］.中国西瓜甜瓜，1990（3）：48－51.

［6］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：353－370.

［7］杨文侠.哈密瓜涂膜保鲜机理的研究［D］.北京：中国农业大学，2005：11.

［8］戴芳澜.真菌的形态和分类［M］.北京：科学出版社，1987：57－64.

［9］甘晓静，黎起秦.作物灰霉病综合防治技术［J］.广西植保，2004，17（4）：13－16.