双层膜放大的电流型癌胚抗原免疫传感器的研究

王丽，孙涛，谭超

（宜宾学院化学与化工学院，宜宾644007）

癌胚抗原（CEA）是分子量为150～300kD的可溶性糖蛋白，主要是由胎儿时期的内胚层衍出而来的胃肠道及肝胰合成，是国际公认的肿瘤标志物之一，目前被普遍应用于恶性肿瘤的辅助诊断、疗效评价和检测复发［1］。健康成人的血清CEA浓度在2.5ng／mL以下，如果血液中CEA浓度突然升高至此值以上，往往与肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝硬化及肝炎等疾病有很大的关系［2］。因此，建立一种快速，准确的方法来检测血液中CEA的含量显得尤为重要。在众多的方法中，电流型免疫传感器由于它检测限低、操作简单和灵敏度高等优点而倍受人们的青睐［3］。

普鲁士蓝（prussian blue，PB），因其具有化学稳定性高、电化学可逆性好、成本低制备简单等特点而引起研究人员的高度重视，在电催化、生物传感器、电显色、二次电池［4－7］等方面应用广泛。此外，由于其对过氧化氢具有良好的催化还原作用，被称为“人造过氧化氢酶”［8］。然而，电子媒介体的渗漏是目前制约电流型传感器发展的一个主要问题。近年来，已有研究［9－11］通过交联，与其他材料复合等方法来克服这个缺点。

纳米颗粒由于具有比表面积大，吸附能力强，生物相容性好等优点，已被广泛用于吸附固定生物分子，基于纳米材料的固载基质制备传感器已成为传感器领域的研究热点。纳米铂，作为典型的金属纳米粒子，除了具有一般纳米颗粒所拥有的优点外，还具有独特的催化还原H2O2的性能。Zou Y等［12］利用纳米铂修饰的碳纳米管制备了葡萄糖生物传感器，该电极对H2O2呈现了高的电催化活性和稳定性，Chu X等［13］制备了基于纳米铂／纳米金和碳纳米管的电流型生物传感器。

本文以普鲁士蓝／纳米铂复合物膜作为固载基质，采用辣根过氧化物酶（HRP）代替常用的牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性吸附位点［14－15］，研制高灵敏的电流型癌胚抗原免疫传感器。由于HRP和普鲁士蓝／纳米铂复合物膜对H2O2具有良好的电催化活性，因此它们放大了电流响应信号和提高了免疫电极的灵敏度。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

CHI 600B型电化学工作站（上海CHI公司）；B204－S电子天平（瑞士 Metter Toledo公司），BRANSONIC200超声清洗仪（德国BRANSONIC ULTRASCHALL公司）。氯铂酸（美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶（HRP，上海丽珠东风生物技术公司）；癌胚抗体（anti.CEA）、癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白抗原（AFP）（郑州博赛生物技术研究所），其他试剂均为分析纯，所用水均为二次水。

不同pH的磷酸缓冲溶液（PBS）用0.1mol／L KH2PO4和0.1mol／L Na2HPO4配制，支持电解质为0.1mol／L KCl。

1.2 免疫传感器的制备

将金电极（Ф＝4mm）依次用0.3mm和0.05 mm的A12O3粉抛光使成镜面，然后依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声清洗。随后把电极置于0.5mol／L的硫酸溶液中在－0.4～1.5V 电位范围内进行循环伏安扫描至稳定。

将预处理的Au电极放入新配的2.5mmol K3Fe（CN）6＋2.5mmol FeCl3＋0.1mol／L KCl和0.1mol／L HCl中，在恒电位＋0.4V下沉积80s，二次水冲洗，然后将其放入0.1mol／L HCl／0.1 mol／L KCl溶液中，在－50～350mV的电位范围内以扫速50mV／s进行循环伏安扫描50圈，室温晾干即得PB修饰电极（PB／Au）［16］，再将修饰电极置于2.0mmol／L H2PtCl6中，以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极于－0.2V下电沉积30s，取出，水洗，得纳米铂修饰电极（Pt／PB／Au）［17］。然后将纳米铂修饰电极（Pt／PB／Au）置于癌胚抗体中于4℃过夜。最后，将已制好的电极浸在HRP（2 mg／mL，pH6.0的PBS）中约2h，以封闭非特异性结合位点。

将制备的电极悬于缓冲液上方，在4℃下保存备用。

1.3 测定方法

本实验采用三电极体系：免疫电极为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极。利用循环伏安法（CV）进行电极制备过程的表征。循环伏安法电位区间为－0.2～0.5V，扫速为50mV／s。

进行免疫测定时，将修饰有抗体的工作电极置于不同浓度的抗原溶液中孵育10min（25℃），测试底液为5mL 0.1mol／L（PBS pH＝6.5）＋ 2.8 mmol／L H2O2，以循环伏安法检测 CEA 的浓度。电位扫描速度为50mV／s，除特别说明，温度均控制为（25±0.5）℃。

2 结果与分析

2.1 电极在自组装过程中的电化学表征

本文采用循环伏安（CV）考察免疫电极在组装过程的电化学性质。

图1为不同修饰电极沉积普鲁士蓝后的CV图。

图1 不同修饰电极的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammograms of the electrodes at different stages

由图1可见：修饰电极在PBS pH＝6.5缓冲溶液中呈现出一对可逆的氧化还原峰（图1a），这表明普鲁士蓝是一种良好的电子媒介体。当纳米铂粒子沉积到电极后，氧化还原峰电流值有所下降（图1b），原因可能是因为形成了一层纳米铂粒子层，它的存在增加了电极表面膜的厚度，阻碍了电子的传递。特别是当修饰电极依次吸附anti－CEA，辣根过氧化物酶（HRP）后，电流进一步降低（图1c），这是由于大分子抗体和辣根过氧化物酶是非导电性物质，阻碍了电子的传输。

图2是纳米铂／普鲁士蓝复合物修饰电极连续扫描20圈的循环伏安图。图2显示：氧化还原峰电流基本没有发生变化，表明纳米铂／普鲁士蓝复合物的形成一定程度上抑制了PB的泄漏。

图2 Pt／PB／Au电极连续扫描的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of the Pt／PB／Au electrodes at continuous scan

为了解修饰电极的反应过程，实验考察了峰电流大小与扫描速率的关系，结果如图3所示。图3显示：扫速在30～400mv／s范围内，随着扫描速度的不断增加，峰电流值也逐渐增加，且氧化还原峰峰电流值与扫描速率的平方根成正比（v1／2），表明电极氧化还原反应是受扩散控制的过程。

图3 免疫电极的扫速图Fig.3 Cyclic voltammograms of the modified electrodes at different Scan rates

2.2 免疫电极的催化特性

本实验利用CV技术考察了免疫电极的电化学催化特性。图4为修饰电极在pH 6.5磷酸缓冲溶液中对H2O2的电化学催化响应图。

由图4可知：在加入H2O2之前，CV图表现出一对较好的氧化还原峰（图4a）；当加入2.8mmol／L H2O2后，氧化峰电流明显减小，还原峰电流显著增加（图4b），表明修饰电极对H2O2有良好的电催化还原性能，同时也说明该免疫传感器在底液中加入H2O2确实有效的放大了电流响应信号，增加了免疫电极的灵敏度。

图4 免疫电极的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of the immunosensor

2.3 实验条件的优化

考察H2O2含量对电极响应性能的影响，结果如图5所示。

图5显示：当 H2O2的浓度小于2.8mmol／L时，随着H2O2的浓度的增加，还原峰电流迅速增加，然后趋向于稳定，这表明H2O2的量在电极表面已经达到饱和。因此，在本实验中H2O2的量选择为2.8mmol／L。

图5 H2O2含量对免疫电极的影响Fig.5 Influence of the amount of H2O2on the sensor response

由于PB的沉积时间对免疫传感器的性能与有直接的关系，因此本文采用CV法考察PB沉积不同的时间对免疫电极响应信号的影响，结果见图6。

从图6可以看出：随着PB沉积时间从20－80s，氧化还原峰的电流逐渐增加，80s时响应电流最大。继续增加PB沉积时间到100s，虽然氧化还原峰的电流增加，但是峰形和峰的可逆性变差。因此，80s是PB的最优沉积时间。

图6 普鲁士蓝的沉积时间对免疫电极的影响Fig.6 Effect of the depositional time of prussian blue on the response of the immunoelectrode

2.4 免疫传感器的响应特性

在最优的实验条件下，采用循环伏安法测定免疫电极对CEA的校正曲线，结果如图7所示。

从图7可以看出：CEA的浓度在1.0～80.0 ng／mL的范围内与单位面积峰电流呈良好的线性关系。其线性方程为y＝0.2802x－128.06，相关系数为0.9951，检测线为0.4ng／mL。

图7 免疫电极的校正曲线Fig.7 Calibration curves for the immunoelectrode

该免疫传感器的测定原理是：（1）纳米铂、普鲁士蓝、HRP同时催化了H2O2的还原，显著放大了电流信号；（2）当抗原与抗体特异性结合后，其复合物形成的空间位阻影响了HRP的催化活性中心，同时也阻碍了普鲁士蓝的氧化还原反应，并且随着抗原浓度的增加氧化还原峰电流逐渐减小。

2.5 免疫传感器的选择性、重现性和稳定性

实验后将传感器于4℃下悬于pH 6.5磷酸缓冲液上方放置1d后，峰电流降低了3.5%，1个月后仅降低了4.9%。表明该免疫电极稳定性良好。

分别取不同批次制备的4支免疫传感器，对60 ng／mL的CEA标准溶液进行检测，其电流响应值的相对标准偏差小于7.5%。表明免疫传感器有良好的重现性。

将修饰好的电极分别置于含有60ng／mL CEA抗原的标准溶液和含有相同CEA浓度以及不同的干扰物质（HCG和AFP）溶液中孵育10min，分别记录响应电流值。结果显示，2次测量结果的偏差小于4.1%。这表明该免疫传感器具有良好的选择性。

3 结语

本文利用普鲁士蓝／纳米铂复合物膜为固载基底、癌胚抗体为模板免疫分子，成功构建了高灵敏的电流型癌胚抗原免疫传感器，与其他传统方法相比，该方法是有以下优势：

（1）纳米铂的引入不仅增加了抗体的固定量，而且它与普鲁士蓝均可直接催化还原H2O2，增强了电流响应信号提高了免疫传感器的灵敏度。

（2）与BSA相比，HRP的引入除了能封闭电极表面的活性位点外，还可以直接催化H2O2，进一步提高电极灵敏度。

（3）在优化的实验条件下，CEA的浓度在1.0～80.0ng／mL的范围内与单位面积峰电流呈良好的线性关系，相关系数为0.9951，检测线为0.4ng／mL。

（4）该传感器制备方法简单，成本低、灵敏度高、选择性好，有望用于临床样品分析。

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