三聚氰胺对嗜热链球菌生长影响的研究

郭丽琼，田雪琴，苏 霞，吴厚玖，曹秋旭，董文博

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.西南大学柑橘研究所，重庆400712)

三聚氰胺对嗜热链球菌生长影响的研究

郭丽琼1，2，田雪琴1，2，苏 霞1，2，吴厚玖2，*，曹秋旭1，2，董文博1

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.西南大学柑橘研究所，重庆400712)

通过在MRS液体培养基里分别添加0‰、0.25‰、0.5‰、1‰、2‰、3‰及饱和的三聚氰胺，接种嗜热链球菌，在42℃下培养48h，通过测定培养液的pH变化和计数细菌总数来考察三聚氰胺对嗜热链球菌生长的影响。结果表明:嗜热链球菌不能以三聚氰胺为氮源物质而加以降解利用，三聚氰胺在水溶解度范围内对嗜热链球菌的生长没有促进作用，只有微弱的抑制效果。

三聚氰胺，嗜热链球菌，生长，影响

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，S.t) 西南大学食品科学学院提供;MRS培养基［4］;脱脂乳培养基 市售完达山脱脂奶粉复水溶解，分装后于108℃灭菌15min;天友牌酸乳、完达山脱脂乳粉 市售;磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、乙醇、葡萄糖、吐温80、硫酸镁、硫酸锰、氢氧化钠 均为分析纯;乙酸钠、三聚氰胺 均为化学纯;结晶紫染色液，碘液，0.5%番红染色液，蒸馏水，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，琼脂粉。

SW.CJ.1F无菌操作台 苏静集团安泰公司;HH B11电热恒温培养箱 上海越近医疗器械厂;pHS－4C+智能pH计酸度计 成都世纪方舟科技有限公司;ES－315高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY公司; B203生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司; DGX－9243 B－1电热鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有创新公司;FA2004电子天平 上海恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化 先用酒精棉将菌种管玻璃表面擦拭消毒，而后于酒精火焰处打开管口，以灭菌铂耳环取之，转移入灭菌脱脂乳试管中。将上述接种完毕的脱脂乳试管置于42℃的恒温培养箱中。培养至凝固再移植到新的脱脂乳试管中，依此类推，传代几次，直至活力恢复到最佳，可据脱脂乳培养基的凝固时间而定［5－6］。

1.2.2 革兰氏染色 活化后的菌种要进行革兰氏镜检，以便确认菌种活力的回复与否以及是否被污染。

1.2.3 嗜热链球菌对三聚氰胺的降解利用实验 实验组:在MRS培养基的基础上改变氮源，即将MRS培养基中的含N成分替换成不同浓度的三聚氰胺(2～6);对照组:缺N培养基(1)和标准MRS培养基(7)。各培养基主要成分如表1。

表1 培养基成分Table 1 The components of culture medium

将培养基配制完成后调节pH至6.8，分装于试管，置于高压蒸汽灭菌锅内121℃高压灭菌20min后冷却待用。将培养于脱脂乳中的嗜热链球菌按2%的接种量分别接种于上述培养基中，置于42℃的恒温培养箱中培养48h，用酸度计测定pH。记录数据，通过观察对照组和实验组的酸度来定性分析三聚氰胺是否能被嗜热链球菌用作N源。

1.2.4 三聚氰胺对嗜热链球菌产酸的影响 在完全MRS液体培养基中添加不同浓度三聚氰胺，调节pH至6.8，分装后置于高压蒸汽灭菌锅内121℃高压灭菌20min后冷却待用。将培养于脱脂乳中的嗜热链球菌按2%的接种量接种于其中，置于42℃的恒温培养箱中培养48h。利用酸度计分别测定24h和48h时培养液的pH。确定三聚氰胺的作用后，重复上述操作，培养24h，每隔3h测定一次pH。记录数据，通过观察pH变化趋势分析三聚氰胺对嗜热链球菌产酸影响。

1.2.5 菌落总数计数 将嗜热链球菌接种于添加有不同浓度的三聚氰胺培养液中进行培养，24h后采用稀释平板菌落计数法对各培养液计数，同时观察菌落形态及其大小并比较。

2 结果与分析

2.1 嗜热链球菌的活化与镜检

通过镜检发现活化后的菌种为纯菌，可用于下一步实验。

2.2 嗜热链球菌对三聚氰胺的降解利用实验

根据现有资料可知乳酸菌的生长与产酸(即pH的下降)具有一定的正相关性［7］，因此，本实验通过测定发酵培养液中的pH变化来反映乳酸菌生长的情况。

按实验方法1.2.3配制各培养基，接种2%的嗜热链球菌，42℃条件下培养48h后测定pH，数据如表2。

表2 以三聚氰胺为氮源的培养液的pH(n=3) Table 2 The pH of cultures with different concentrationsof melamine as nitrogen sources(n=3)

据表2可知，嗜热链球菌在标准MRS液体培养基7中生长42h，pH降至3.20，说明嗜热链球菌在该培养基中生长良好，产酸较好。但在去除了N源的培养基1中，嗜热链球菌在培养42h后pH为5.16，较完全培养基高1.96，表明在无N源条件下嗜热链球菌的生长明显受到抑制。通过添加不同浓度的三聚氰胺后，与缺N培养液相比，其pH没有下降反而有微弱的上升趋势，最高达到5.88，表明在N源严重不足的情况下，三聚氰胺作为一种高氮化合物没有被嗜热链球菌所利用。故可判定三聚氰胺不能作为N源被嗜热链球菌利用。

同时，随着三聚氰胺浓度的逐渐增大，相应培养液的pH由5.30逐渐上升至5.88，即嗜热链球菌的产酸量在逐渐下降。初步判定三聚氰胺可能会抑制嗜热链球菌的生长。

2.3 三聚氰胺对嗜热链球菌产酸的影响

2.3.1 三聚氰胺对嗜热链球菌生长影响判定 由表3可知，24h时，添加了不同浓度三聚氰胺的完全培养基的pH为3.42～3.58，较对照组的3.36稍高，即实验组的产酸能力较对照组的稍低，说明三聚氰胺对嗜热链球菌的生长并没有促进作用，而只有较弱的抑制作用;在三聚氰胺的水溶解度范围内，三聚氰胺浓度达到饱和状态时，其pH3.58最高，表明在饱和浓度时其抑制作用最强。

表3 添加不同浓度三聚氰胺的完全培养液发酵后的pH(n=3)Table 3 The pH of cultures with different concentrations of melamine(n=3)

此外，培养液的pH在24～48h间变化值(≤0.16)很小，说明嗜热链球菌在0～24h内已完成其生长周期。

2.3.2 三聚氰胺对嗜热链球菌产酸的影响 由图1可知。

在三聚氰胺的水溶解度范围内，随着其浓度的增大，培养24h后培养液的pH也在逐渐增大，表明三聚氰胺对嗜热链球菌的抑制作用与其浓度具有一定的正相关性。

3～12h期间各培养液的pH下降速度较快，对照组pH变化值可达1.94，说明此时间段嗜热链球菌的生长较为迅速，处于对数期;添加了三聚氰胺的培养液的pH下降速度和幅度都较对照的小，特别在3～6h期间表现尤为明显，说明三聚氰胺的抑制作用主要发生在此期间。此外，由图1可看出三聚氰胺的存在延长了嗜热链球菌的生长延滞期，嗜热链球菌的生长产酸受到部分抑制，且这种作用随三聚氰胺浓度的升高而增加。而后在12～24h时间段内，嗜热链球菌的生长趋于稳定，pH的下降速度也趋于稳定。故三聚氰胺的抑制作用主要发生在嗜热链球菌生长的初期。

图1 添加不同浓度三聚氰胺的培养液发酵后的pHFig.1 Comparison of the pH of cultures with different concentrations of melamine

2.4 三聚氰胺对嗜热链球菌菌落总数的影响

由图2可知，随三聚氰胺浓度的增加，嗜热链球菌的菌落总数有所降低，但下降的数量不大，不超过200个菌落。通过对实验组和对照组上的菌落形态和大小进行观察和比较，结果表明添加三聚氰胺与否，嗜热链球菌的菌落形态没有发生显著变化，但其大小有较明显的变化，其中添加饱和浓度三聚氰胺的菌落直径最小，说明饱和浓度的三聚氰胺对嗜热链球菌的生长抑制作用最大。

3 结论

本实验利用含有不同浓度三聚氰胺的MRS培养基作实验培养基，观察三聚氰胺对嗜热链球菌生长的影响。通过检测发酵过程中pH、活菌数以及菌落形态的变化，利用显微镜观察嗜热链球菌的菌体形态来进行分析。结果表明三聚氰胺不能作为N源被嗜热链球菌所利用，相反对嗜热链球菌的生长有不显著的抑制作用。其抑制作用表现在生长初期，使嗜热链球菌的延滞期延长，且效果随三聚氰胺浓度的增加而更加明显，三聚氰胺浓度达到饱和状态时其抑制作用最强，而在生长的中后期不明显。随三聚氰胺浓度的增加，嗜热链球菌的菌落总数有所降低，但下降的数量不超过200个菌落数。菌落大小随三聚氰胺的浓度增大有所减小，特别是在饱和浓度时，菌落直径比空白实验的菌落直径小得多。故三聚氰胺对嗜热链球菌的生长影响不大，在原料乳中添加三聚氰胺后并不能影响其发酵酸奶的作用。

图2 添加不同浓度三聚氰胺培养液中嗜热链球菌的菌落总数比较Fig.2 Comparison of the numbers of Streptococcus thermo philus in the medium added different concentrations of melamine

［1］李臣，周洪星，石骏，等.三聚氰胺的特性及其检测［J］.农产品加工，2009(1):62－63.

［2］何绮霞.正确认识三聚氰胺［J］.广东饲料，2008，17(10): 32－34.

［3］郜洪涛，吕嘉枥，闫肃，等.嗜热链球菌对酸奶发酵的影响及应用前景［J］.中国酿造，2010(11):5－9.

［4］GB/T 4789.35－2008食品卫生微生物学检验，食品中乳酸菌检验［S］.

［5］王建芳，陈芳，靳亚平.嗜热链球菌适宜培养条件研究［J］.西北农业学报，2008，17(2):56－58.

［6］曹荣安，韩建春，孔保华，等.巴西菇对嗜热链球菌生长影响的研究［J］.食品工业科技，2006，27(1):79－80.

［7］林召丰，王子龙，王志耕.酸奶在冷藏过程中酸度、粘度和双乙酰的变化和关系研究［J］.包装与食品机械，2009，27(3): 22－24.

Study on the effect of melamine on the growth of Streptococcus thermophilus

GUO Li－qiong1，2，TIAN Xue－qin1，2，SU Xia1，2，WU Hou－jiu2，*，CAO Qiu－xu1，2，DONG Wen－bo1
(1.Food Science College of Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Citrus Research Institute of Southwest University，Chongqing 400712，China)

MRS liquid mediums added respectively with 0‰，0.25‰，0.5‰，1‰，2‰，3‰and saturation concentration melamine were used to cultivate Streptococcus thermophilus.After 48h at 42℃in the culture medium，the impaction of melamine on the growth of Streptococcus thermophilus was tested through measuring the pH of the medium and calculating the final total number of bacteria.The experimental results showed that melamine couldn’t be used and degraded by Streptococcus thermophilus as a nitrogen and melamine within the water solubility couldn’t promote the growth of Streptococcus thermophilus while it had a little inhibition effect on the growth of it.

melamine;Streptococcus thermophilus;growth;effect

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0226－03

三聚氰胺是一种白色结晶粉末，含氮量高(约66.67%)，无异味。因利用常规方法不能检测出其在食品和饲料中的添加量。为了提高奶制品的含氮量，不法商人将其添加到饲料原料和奶制品中，从而对人和动物带来危害［1］。自2008年9月我国发生的三鹿奶粉中“三聚氰胺”致婴幼儿中毒的重大食品安全事故后，近来又相继发生了多起乳制品中三聚氰胺含量超标事件，对我国乳业产生了巨大冲击。我国对乳中三聚氰胺的限量标准规定:婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg;液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。但其标准水平不会设为“0mg/kg”，因为三聚氰胺会通过包装材料或食物链富集作用存在于食品中［2］。嗜热链球菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌［3］，属于乳酸菌的一种，主要用于发酵工业，特别是酸乳的发酵。本实验主要通过观察三聚氰胺对嗜热链球菌生长及产酸能力是否存在影响，判断能否通过发酵酸奶的酸度变化来判定奶中三聚氰胺存在与否及其含量的大小。同时观察奶中的三聚氰胺能否通过嗜热链球菌的发酵作用来降解，从而使得奶中三聚氰胺含量降低。

2011－08－29 *通讯联系人

郭丽琼(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:农产品加工及贮藏工程。