植物中酪氨酸酶的筛选及不同抑制剂对其活性的影响

樊 倩，韦庆益，袁尔东，江 洪，曾素滢，宁正祥，*，高建华

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640; 2.华中农业大学理学院化学系，湖北武汉430700)

植物中酪氨酸酶的筛选及不同抑制剂对其活性的影响

樊 倩1，韦庆益1，袁尔东1，江 洪2，曾素滢1，宁正祥1，*，高建华1

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640; 2.华中农业大学理学院化学系，湖北武汉430700)

以新鲜马铃薯、红富士苹果、红蛇果、秀珍菇和紫茄子为研究对象，从中分别提取酪氨酸酶并测定其酶活力，发现紫茄子中提取的酪氨酸酶具有最大酶活力。因此选紫茄子中提取的酪氨酸酶做进一步研究。选邻苯二酚作为茄子酪氨酸酶底物，进一步研究了有机类、无机类和天然类三大类抑制剂对酪氨酸酶催化活性的影响，并测定了这些抑制剂的IC50值。

酪氨酸酶，提取，抑制剂

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜土豆、红富士、红蛇果、秀珍菇、紫茄子 当地市场;牛血清蛋白 Roche公司;肉桂酰甘氨酸甲酯(a1)、肉桂酰甘氨酸乙酯(a2)、肉桂酰甘氨酸丙酯(a3)、肉桂酰甘氨酸正丁酯(a4)、肉桂酰苯丙氨酸乙酯(b1)、阿魏酰苯丙氨酸乙酯(b2) 本实验室按照文献［6］合成;二氢杨梅素、芦丁 陕西慧科植物开发有限公司;焦磷酸钠、亚硫酸氢钠 分析纯;邻苯二酚 南京化学试剂有限公司;DMSO 广州化学试剂厂;其余实验室常用试剂 均为分析纯。

低温离心机 德国HETTICH公司;UV－1901紫外可见分光光度计 北京普析公司;其余为实验室常规器材。

1.2 实验方法

1.2.1 酪氨酸酶的提取 取植物材料25g按1∶2 (W/V)比例与冷的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(含20mmol/L抗坏血酸)混合，植物组织匀浆器匀浆2～3min，纱布过滤，滤液以 6500r/min低温离心10min，弃去沉淀得粗酶提取液。测量上清液体积，留取1mL用于测定蛋白含量和酶活力。

1.2.2 盐析及蛋白含量测定［7］以马铃薯粗提液为例。向马铃薯粗提液中加入不同饱和度的固体硫酸铵，饱和度分别为45%、55%、65%、75%。再以6000r/min离心20min，收集沉淀。将沉淀溶解在10mL上述缓冲溶液中。用考马斯亮蓝法测定酶液的蛋白含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，于595nm处测定吸光度，做工作曲线，得到蛋白质浓度与吸光度之间的关系，样品蛋白质浓度对照标准曲线获得。酶得率按照公式:酶得率(%)=纯化酶活力/粗提酶活力×100%计算。

1.2.3 酶活力的测定 采用比色法。在含有0.93mL磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)的离心管中加入50μL、0.025mol/L的邻苯二酚溶液，接着加入20μL酶液，迅速摇匀，在紫外可见分光光度计390nm处测定时间扫描值。使OD值变化量在0.1～0.4/min。按照公式:相对酶活力=OD值/蛋白含量计算酶的相对活力。

1.2.4 抑制剂对酪氨酸酶的抑制效果测定［8］1.5mL离心管中加入880μL pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L)和一定体积的样品溶液(DMSO溶解)，用DMSO补齐至930μL，加入20μL酪氨酸酶溶液，于25℃恒温静置10min，加入50μL邻苯二酚，迅速混匀，立即测定混合液在波长390nm处吸光度随时间变化的曲线。调整酶浓度，使吸光度的变化保持在每分钟0.1个单位。

2 结果与分析

2.1 粗酶液盐析条件的确定

以马铃薯粗提酶为例。从图1可以看出，当硫酸铵饱和度达到65%时，粗提酪氨酸酶液的纯化酶得率达到了最大值，为89.94%。超过此饱和度，在75%时酶得率反而急剧下降，仅为39.31%。因此，选取饱和度为65%的硫酸铵用于盐析纯化各类材料的粗提酶液。

图1 不同饱和度的硫酸铵对粗酶液盐析效果的影响Fig.1 Effect of ammonium sulfate with different concentrations on salting out of crude tyrosinase extract

2.2 相对酶活力的测定

从马铃薯、红富士、红蛇果、秀珍菇、紫茄子五种原料中提取酪氨酸酶的结果如表1所示。

几种原料中，马铃薯提取物中蛋白含量最高，紫茄子次之，红蛇果最低。相对酶活力数据显示，其他四类原料中提取的酪氨酸酶相对酶活力都比紫茄子低一个数量级。因此可以得到，紫茄子相对酶活力最高，最适宜作为提取酪氨酸酶的原料，选择从紫茄子中提取的酪氨酸酶作为进一步研究对象。

表1 几种植物中提取的天然酪氨酸酶Table 1 Natural tyrosinase extracted from several plants

2.3 不同类型的抑制剂对提取的酪氨酸酶活性的影响

2.3.1 有机类抑制剂对酪氨酸酶活性的影响 由图2可知，随着抑制剂浓度的增大，酪氨酸酶活性有明显降低趋势。从表2中看出，对于前四种肉桂酰甘氨酸酯类，他们对酪氨酸酶的抑制作用随着氨基酸酯末端碳链的增长而增强。他们能力的大小按如下顺序排列:a4＞a3＞a2＞a1。可能是随着碳链增长，化合物的疏水性增强，这使得抑制剂本身与靠近酪氨酸酶活性中心的疏水区域结合的更加紧密。b1和b2则是由于苯环上取代基的不同而表现出不同程度的抑制作用，其顺序是b2＞b1。我们推测，是由于苯环间位的羟基被甲氧基取代，从而使得化合物本身与酶或酶－底物复合物结合的更加紧密。至于b1的抑制作用没有a2强的原因，则可能是因为二者结构中氨基酸基团的不同，b1中的苯丙氨酸结构明显要比a2中的甘氨酸结构占据更多的空间，这样就形成了更大的空间位阻效应，阻止了自身与酶的结合。我们之前曾用纯酶研究了a1、a2、a3、a4、b1和b2等有机合成抑制剂对酪氨酸酶的抑制作用，发现抑制活性顺序和IC50在数量级上与用天然酪氨酸酶粗提物研究的结果一致。

图2 有机类抑制剂对酪氨酸酶活性的影响Fig.2 Effect of organic inhibitors on tyrosinase activity

2.3.2 无机物质对酪氨酸酶活性的影响 酪氨酸酶活性随着这两类抑制剂浓度的增大而降低，其中亚硫酸氢钠的抑制作用较弱。表2中结果显示，亚硫酸氢钠的IC50值约是焦磷酸钠IC50的1.3倍。研究这两类无机盐对酪氨酸酶活性的影响，可以为实验或生产提供一定的参考。

2.3.3 天然提取物对酪氨酸酶活性的影响 对比发现，芦丁的IC50比二氢杨梅素要高出一个数量级，可见，二氢杨梅素对酪氨酸酶有较强的抑制作用。刘德育［10］等人也曾报道二氢杨梅素对酪氨酸酶有显著的抑制作用，其IC50是0.082mmol/L。究其原因，可能是二氢杨梅素比芦丁的分子结构要小的多，这样更有利于与酶或酶－底物复合物的结合;相反，芦丁复杂的空间结构造成了巨大的空间位阻，使其与酶或酶－底物复合物不易结合。

表2 各类抑制剂抑制酪氨酸酶的IC50值Table 2 IC50values of different inhibitors on tyrosinase inhibition

3 结论

本文研究了天然酪氨酸酶的筛选及各类抑制剂对天然源酪氨酸酶活性的影响。酪氨酸酶广泛存在于动植物、微生物体内，对生物体各类生命活动、病变都有重要影响。研究酪氨酸酶及其抑制剂，对于医疗、美白、食品保鲜等领域，有着重要的指导意义。本文所研究的5类提取酪氨酸酶的材料中，发现紫茄子所含的酪氨酸酶具有最理想的酶活力，因此是提取酪氨酸酶的最佳原材料。有机合成、无机盐和天然提取物三大类抑制剂中，有机合成的化合物对酪氨酸酶有最佳抑制效果，其中a3、a4、b2的IC50值分别为0.044、0.040、0.066mmol/L。天然提取的二氢杨梅素的IC50值也达到了0.068mmol/L。本文利用提取的天然源酪氨酸酶粗提物为基础研究各类抑制剂对其影响，可为酪氨酸酶抑制的初步筛选提供重要参考。

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Selection of tyrosinase from botany and the influence of different inhibitors on its activity

FAN Qian1，WEI Qing－yi1，YUAN Er－dong1，JIANG Hong2，ZENG Su－ying1，NING Zheng－xiang1，*，GAO Jian－hua1
(1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China; 2.Department of Chemistry，School of Science，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430700，China)

Fresh potatoes，Red Fuji apples，Red Delicious apples，Pleurotus geesteranus and purple eggplants were used，which tyrosinase was isolated and its enzyme activities were determined.Results showed that tyrosinase isolated from purple eggplants had the strongest activity.Consequently，tyrosinase of purple eggplants was chose to take further research，in which catechol was used as the substrate of tyrosinase.And the influence of three types of inhibitors organic，inorganic and natural inhibitors，on the catalytic activity of tyrosinase was discussed，while their IC50values were assayed.

tyrosinase;isolate;inhibitors

TS201.2+5

A

1002－0306(2012)10－0091－03

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一类多功能酶，它不仅可以催化一元酚的羟基化反应，还可以催化o－二元酚氧化成o－醌的反应［1］。它的活性中心含有铜离子，这类酶广泛分布在微生物和动植物体内［2］。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，也是引起果蔬酶促褐变的主要因素［3］，同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响［4］。由于酪氨酸酶广泛存在，因此在美白、保鲜、杀虫等方面有着良好的应用前景。如今，人们已经从微生物、植物及动物体内提取并纯化了酪氨酸酶，对酪氨酸酶的研究主要集中在分离纯化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面［5］。本文选取不同的果蔬，从中提取并筛选了具有最大活性酪氨酸酶的品种，进而研究了不同的抑制剂对其抑制作用，这一研究可以为酪氨酸酶抑制剂的初步筛选提供重要参考。

2011－09－06 *通讯联系人

樊倩(1987－)，女，在读硕士，研究方向:酪氨酸酶抑制剂。

自然科学基金项目(20702016);华南理工大学教学研究基金(Y1100100)。